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①. 人正常組織來源細胞基因載體的構(gòu)建：把目的基因和與細胞內(nèi)靶基因特異片段同源的DNA 分子都重組到帶有標(biāo)記基因(如neo 基因，TK 基因等)的載體上，成為重組載體。基因敲除是為了使某一基因失去其生理功能，所以一般設(shè)計為替換型載體。
 
②.ES 細胞的獲得：現(xiàn)在基因敲除一般采用是胚胎干細胞，zui常用的是鼠，而兔，豬，雞等的胚胎干細胞也有使用。常用的鼠的種系是129及其雜合體，因為這類小鼠具有自發(fā)突變形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的傾向，是基因敲除的理想實驗動物。而其他遺傳背景的胚胎人正常組織來源細胞也逐漸被發(fā)展應(yīng)用。
 
③.同源重組：將重組載體通過一定的方式(電穿孔法或顯微注射)導(dǎo)入同源的胚胎干細胞(ES cell)中，使外源DNA 與胚胎干細胞基因組中相應(yīng)部分發(fā)生同源重組，將重組載體中的DNA 序列整合到內(nèi)源基因組中，從而得以表達。
 
④.選擇篩選已擊中的細胞：由于基因轉(zhuǎn)移的同源重組自然發(fā)生率極低，動物的重組概率為10-2 ～10-5 ，植物的概率為10-4 ～10-5 。因此如何從眾多細胞中篩出真正發(fā)生了同源重組的胚胎干細胞非常重要。目前常用的方法是正負篩選法(PNS法)，標(biāo)記基因的特異位點表達法以及PCR 法。其中應(yīng)用zui多的是PNS法。
 
⑤.表型研究：通過觀察嵌和體小鼠的生物學(xué)形狀的變化進而了解目的基因變化前后對小鼠的生物學(xué)形狀的改變，達到研究目的基因的目的。
 
⑥.人正常組織來源細胞得到純合體：由于同源重組常常發(fā)生在一對染色體上中一條染色體中,所以如果要得到穩(wěn)定遺傳的純合體基因敲除模型，需要進行至少兩代遺傳。