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qPCR實驗常見問題及解決方法
PCR是聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction）的簡稱，是一種選擇性體外快速擴增DNA片段的方法。在體外以類似于細胞內DNA的半保留復制過程，以擬擴增的模板DNA分子，與模板DNA互補的寡核苷酸引物、DNA聚合酶、4種dNTP及適合的緩沖體系組成的反應體系，經過重復地變性一退火一延伸三步，擴增新的目的DNA鏈，這個過程通過控制反應體系的溫度來實現。可以在短時間內將微量的DNA片段擴增到足夠數量，用于后續的研究和檢測。下面讓我們一起來看看qPCR實驗的常見問題及解決方法吧！
一、擴增曲線不穩定
可能原因
RNA純度低；體系中存在較多雜質；儀器使用時間過長。
解決方案
1）提取高純度的RNA，小心操作。
2）對儀器進行校準。
二、擴增無法達到平臺期
可能原因
模板濃度太低；循環數太少；試劑擴增效率低。
解決方案
1) 提高模板量
2) 提高循環數
3) 用標準曲線測定擴增效率，提高鎂離子濃度，換用擴增效率高的試劑。
三、熒光下降
可能原因
存在降解；模板濃度過高。
解決方案
1) 提高體系純度
2) 降低模板量
3) 降低熒光閾值
四、單峰、峰不尖銳
可能原因
與試劑成分有關；或存在大小相近的非特異性擴增。
解決方案
1) 溫度跨度不高于7度，視為可用結果
2) 進行高濃度瓊脂糖電泳，確認是否為單一條帶。
五、單峰，Tm低于80度
可能原因
只有引物二聚體，無目的條帶；或擴增片段過短。
解決方案
1) 檢查是否加入模板
2) 進行瓊脂糖電泳檢測，確定條帶大小是否正確
六、雙峰，較低峰Tm在80度之前
可能原因
由于模板濃度過低或引物濃度過高使多余引物形成引物二聚體。
解決方案
1) 適當提高退火溫度
2) 提高模板量，降低引物濃度
3) 重新設計引物。
七、qPCR注意事項
·提高樣品純度，盡量減少樣品之間的交叉污染。
·每個樣品至少要做3個平行孔，以防在 后面的數據分析中，由于Ct相差較多或者SD太大，無法進行統計分析。
·MasterMix不要反復凍融，如果經常使用，最好融解后放 在4℃；配置體系時在冰上操作；減少加樣誤差，每管或每孔都要換新槍頭，不要連續用同一個槍頭加樣；所有成分加完后，離心去除氣泡。
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