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頂刊藥篩的選擇？發(fā)Cell和新冠藥篩都需要用到它
藥物篩選無論在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域或是藥物開發(fā)領(lǐng)域都是十分重要的環(huán)節(jié)，在這個過程中篩選得到靶向特定靶點的高生理活性的化合物無疑是至關(guān)重要的。
現(xiàn)如今繁多的化合物種類和日漸增加的新靶點，都指向了高通量藥物篩選的必要性，而無論是使用較為傳統(tǒng)的ELISA，還是通過FRET、HTRF等方法，都可以通過高通量藥物篩選平臺SpectraMax Paradigm進行檢測，一次性完成6、24、96、384乃至1536/3456孔板的檢測，極大地提高了實驗效率和準(zhǔn)確性，能夠更好地滿足實際實驗中藥物篩選需要。無論是發(fā)表在Cell上，篩選靶向TLS抗腫瘤藥物的研究，還是在新冠大流行背景下，對靶向新型冠狀病毒主蛋白酶的抗病毒藥物的篩選，或者是在常規(guī)實驗中檢測細胞內(nèi)H2O2水平的需求，都可以通過SpectraMax Paradigm這一臺儀器完成，下文將具體就相關(guān)實驗的設(shè)計、結(jié)果與具體實驗流程展開介紹。
1. A Small Molecule Targeting Mutagenic Translesion Synthesis Improves Chemotherapy Cell 66.850
在腫瘤治療領(lǐng)域當(dāng)中，傳統(tǒng)的通過損傷DNA的方式殺傷腫瘤細胞的化學(xué)療法一直具有無法取代的地位。而在這種治療之下，細胞可以通過跨損傷合成（TLS）這個過程利用專門化的DNA聚合酶從而繞開DNA損傷的區(qū)域，以犧牲DNA保真度為代價促進細胞存活。而此篇文章的重大意義在于通過篩選找到了這樣一種可以靶向TLS過程的小分子抑制劑JH-RE-06，可以阻止誘變POLζ的募集來破壞誘變TLS，并且通過后續(xù)實驗驗證得到順鉑、JH-RE-06可雙藥聯(lián)合相較于順鉑的單藥化療來說對小鼠的耐藥腫瘤模型上顯示出更顯著的腫瘤抑制作用，并且可以降低由于化療所引起的繼發(fā)性腫瘤的可能性，從而降低傳統(tǒng)化學(xué)治療的副作用。
在這個過程中，作者從LOPAC 文庫和PRESTWICK 文庫中篩選了1萬個結(jié)構(gòu)不同的化合物，也在KCB（Korea Chemical Bank）化合物庫中篩選了具有代表性的化合物。最終鑒定得到JH-RE-06，可以10mM濃度下有效地抑制REV1-REV7相互作用，作為后續(xù)的研究對象[1]。
FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer，熒光共振能量轉(zhuǎn)移） 基于非輻射的能量躍遷。將一個蛋白上耦聯(lián)供體（donor），另一個蛋白上耦聯(lián)受體（acceptor），以下圖為例即供體為CFP，受體為YFP。當(dāng)兩個蛋白間距離較遠時，CFP可以在433nm波長的熒光激發(fā)下發(fā)射475nm波長的熒光，而YFP不被激發(fā)；只有當(dāng)供體和受體靠近時，即兩個蛋白之間存在相互作用時，可以發(fā)生FRET，使得YFP被激發(fā)，產(chǎn)生波長為530nm的熒光。可以應(yīng)用于細胞內(nèi)分子間相互作用、細胞膜受體蛋白之間相互作用等研究。而使用高通量藥物篩選平臺SpectraMax Paradigm的FI卡盒（Fluorescence Intensity）可以同時完成對雙熒光信號的檢測，檢測速度更快且結(jié)果更準(zhǔn)確，不受光源強度、電壓等變化的影響。
FRET原理（Yamao, Masataka et al. PloS one. 25 Oct. 2016）
2. Both Boceprevir and GC376 ef?caciously inhibit SARS-CoV-2 by targeting its main protease Nature communications 17.694
中國科學(xué)院微生物研究所齊建勛課題組在Nature Communications上發(fā)表的研究證實丙肝藥物博賽潑維（Boceprevir）和GC376（臨床前期藥物，針對貓傳染性腹膜炎病毒的抑制劑）可以通過靶向新型冠狀病毒的主蛋白酶（main protease，Mpro）起到病毒抑制作用。
Table 1. 18種待篩抗蛋白酶化合物新冠病毒的主蛋白酶在病毒多聚蛋白的加工和成熟過程中起到重要作用，也因此是研發(fā)治療新冠病毒藥物的重要靶點。首先，作者發(fā)現(xiàn)了新冠病毒Mpro與其他冠狀病毒Mpro之間的同源性，因此選擇了靶向不同病毒蛋白酶和蛋白酶體的18種化合物進行進一步篩選（Table 1）。
Figure 1. 高通量藥物篩選
進一步作者通過在單一濃度下，在體外進行FRET實驗對這些化合物進行篩選（Figure 1 a, b）。最終發(fā)現(xiàn)有兩種抑制劑，即Boceprevir 和GC376，可以很好地抑制酶活性。RFU值（relative ?uorescence units）是在37度的條件下，激發(fā)波長為360nm，發(fā)射波長為490nm，使用高通量藥物篩選平臺SpectraMax Paradigm檢測1小時得到[2]。
3. Involvement of NADPH oxidase 1 in UVB-induced cell signaling and cytotoxicity in human keratinocytes Biochem Biophys Rep. 3.322
Glady, Azela等人在這篇文章中試圖探究UVB-誘導(dǎo)的活性氧的來源和作用，最終得出結(jié)論：Nox-1介導(dǎo)的ROS的產(chǎn)生，是UBV通過p38激活和炎性細胞因子生成所導(dǎo)致的細胞毒性和炎癥所必須的，所以，作者認為Nox-1可以作為UVB接觸后所產(chǎn)生的細胞毒性和炎癥的一個可能的治療靶點。
在實驗的過程中作者需要對細胞內(nèi)的H2O2水平進行檢測，主要通過向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染H2O2敏感性探針pHyPer cDNA質(zhì)粒，在完成穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建后通過使用高通量藥物篩選平臺SpectraMax Paradigm對細胞熒光進行檢測，YFP與CFP激發(fā)波長的比值用來衡量細胞內(nèi)H2O2的水平[3]。
Figure 1G作者通過對Nox1的敲除發(fā)現(xiàn)可以抑制UVB誘導(dǎo)的即時或遲發(fā)的細胞內(nèi)H2O2水平的升高，可以看出Nox1-siRNA組在UVB處理0.5h、3h和10h時，YFPex/CFPex的比值顯著低于對照組（Figure 1G）。
高通量藥物篩選平臺SpectraMax Paradigm
高通量藥物篩選平臺SpectraMax Paradigm可以進行光吸收、熒光、時間分辨熒光（包括 HTRF）、熒光偏振、AlphaScreen、AlphaLISA 以及化學(xué)發(fā)光的檢測。檢測卡盒式的模塊化設(shè)計，不僅可以滿足目前檢測的需求，還可以根據(jù)未來應(yīng)用需求靈活的進行升級，通過插入新功能檢測卡盒，僅需要短短幾分鐘完成對讀板機的升級，是您藥物篩選的得力助手。
現(xiàn)如今繁多的化合物種類和日漸增加的新靶點，都指向了高通量藥物篩選的必要性，而無論是使用較為傳統(tǒng)的ELISA，還是通過FRET、HTRF等方法，都可以通過高通量藥物篩選平臺SpectraMax Paradigm進行檢測，一次性完成6、24、96、384乃至1536/3456孔板的檢測，極大地提高了實驗效率和準(zhǔn)確性，能夠更好地滿足實際實驗中藥物篩選需要。無論是發(fā)表在Cell上，篩選靶向TLS抗腫瘤藥物的研究，還是在新冠大流行背景下，對靶向新型冠狀病毒主蛋白酶的抗病毒藥物的篩選，或者是在常規(guī)實驗中檢測細胞內(nèi)H2O2水平的需求，都可以通過SpectraMax Paradigm這一臺儀器完成，下文將具體就相關(guān)實驗的設(shè)計、結(jié)果與具體實驗流程展開介紹。
1. A Small Molecule Targeting Mutagenic Translesion Synthesis Improves Chemotherapy Cell 66.850
在腫瘤治療領(lǐng)域當(dāng)中，傳統(tǒng)的通過損傷DNA的方式殺傷腫瘤細胞的化學(xué)療法一直具有無法取代的地位。而在這種治療之下，細胞可以通過跨損傷合成（TLS）這個過程利用專門化的DNA聚合酶從而繞開DNA損傷的區(qū)域，以犧牲DNA保真度為代價促進細胞存活。而此篇文章的重大意義在于通過篩選找到了這樣一種可以靶向TLS過程的小分子抑制劑JH-RE-06，可以阻止誘變POLζ的募集來破壞誘變TLS，并且通過后續(xù)實驗驗證得到順鉑、JH-RE-06可雙藥聯(lián)合相較于順鉑的單藥化療來說對小鼠的耐藥腫瘤模型上顯示出更顯著的腫瘤抑制作用，并且可以降低由于化療所引起的繼發(fā)性腫瘤的可能性，從而降低傳統(tǒng)化學(xué)治療的副作用。
Figure 1 阻斷 REV1 CTD-REV7相互作用的小分子抑制劑JH-RE-06的發(fā)現(xiàn)與其特征
在化合物的篩選步驟中應(yīng)用到了ELISA實驗。在 ELISA 實驗(Figure 1A)中，將純化后共表達REV3肽鏈的 His8-REV7固定在 Ni2+-NTA 包被的孔中，并通過辣根過氧化物酶(HRP)耦聯(lián)的抗FLAG抗體檢測其在小分子抑制劑存在情況下結(jié)合FLAG標(biāo)記的cREV1 CTD的能力。作者選擇TMB作為底物，反應(yīng)結(jié)束后通過使用高通量藥物篩選平臺SpectraMax Paradigm檢測450nm處的吸光度來尋找可以和REV1 CTD-REV7相互作用的小分子。在這個過程中，作者從LOPAC 文庫和PRESTWICK 文庫中篩選了1萬個結(jié)構(gòu)不同的化合物，也在KCB（Korea Chemical Bank）化合物庫中篩選了具有代表性的化合物。最終鑒定得到JH-RE-06，可以10mM濃度下有效地抑制REV1-REV7相互作用，作為后續(xù)的研究對象[1]。
FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer，熒光共振能量轉(zhuǎn)移） 基于非輻射的能量躍遷。將一個蛋白上耦聯(lián)供體（donor），另一個蛋白上耦聯(lián)受體（acceptor），以下圖為例即供體為CFP，受體為YFP。當(dāng)兩個蛋白間距離較遠時，CFP可以在433nm波長的熒光激發(fā)下發(fā)射475nm波長的熒光，而YFP不被激發(fā)；只有當(dāng)供體和受體靠近時，即兩個蛋白之間存在相互作用時，可以發(fā)生FRET，使得YFP被激發(fā)，產(chǎn)生波長為530nm的熒光。可以應(yīng)用于細胞內(nèi)分子間相互作用、細胞膜受體蛋白之間相互作用等研究。而使用高通量藥物篩選平臺SpectraMax Paradigm的FI卡盒（Fluorescence Intensity）可以同時完成對雙熒光信號的檢測，檢測速度更快且結(jié)果更準(zhǔn)確，不受光源強度、電壓等變化的影響。
FRET原理（Yamao, Masataka et al. PloS one. 25 Oct. 2016）
2. Both Boceprevir and GC376 ef?caciously inhibit SARS-CoV-2 by targeting its main protease Nature communications 17.694
中國科學(xué)院微生物研究所齊建勛課題組在Nature Communications上發(fā)表的研究證實丙肝藥物博賽潑維（Boceprevir）和GC376（臨床前期藥物，針對貓傳染性腹膜炎病毒的抑制劑）可以通過靶向新型冠狀病毒的主蛋白酶（main protease，Mpro）起到病毒抑制作用。
Table 1. 18種待篩抗蛋白酶化合物
Figure 1. 高通量藥物篩選
進一步作者通過在單一濃度下，在體外進行FRET實驗對這些化合物進行篩選（Figure 1 a, b）。最終發(fā)現(xiàn)有兩種抑制劑，即Boceprevir 和GC376，可以很好地抑制酶活性。RFU值（relative ?uorescence units）是在37度的條件下，激發(fā)波長為360nm，發(fā)射波長為490nm，使用高通量藥物篩選平臺SpectraMax Paradigm檢測1小時得到[2]。
3. Involvement of NADPH oxidase 1 in UVB-induced cell signaling and cytotoxicity in human keratinocytes Biochem Biophys Rep. 3.322
Glady, Azela等人在這篇文章中試圖探究UVB-誘導(dǎo)的活性氧的來源和作用，最終得出結(jié)論：Nox-1介導(dǎo)的ROS的產(chǎn)生，是UBV通過p38激活和炎性細胞因子生成所導(dǎo)致的細胞毒性和炎癥所必須的，所以，作者認為Nox-1可以作為UVB接觸后所產(chǎn)生的細胞毒性和炎癥的一個可能的治療靶點。
在實驗的過程中作者需要對細胞內(nèi)的H2O2水平進行檢測，主要通過向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染H2O2敏感性探針pHyPer cDNA質(zhì)粒，在完成穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建后通過使用高通量藥物篩選平臺SpectraMax Paradigm對細胞熒光進行檢測，YFP與CFP激發(fā)波長的比值用來衡量細胞內(nèi)H2O2的水平[3]。
Figure 1G
高通量藥物篩選平臺SpectraMax Paradigm