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核酸分離純化實(shí)驗(yàn)技術(shù)指南
核酸分離純化實(shí)驗(yàn)技術(shù)指南：
總RNA提取常見問題分析
RNA降解
1. 新鮮細(xì)胞：如果試劑沒有問題，且外源性污染也可以排除，那么降解幾乎都來自裂解液的用量不足。如 果將裂解液直接加入培養(yǎng)皿中裂解細(xì)胞，一定要使裂解液能覆蓋住細(xì)胞。
2. 新鮮組織：某些富含內(nèi)源核酸酶的樣品(如肝臟，胸腺等)，即使使用電動(dòng)勻漿器勻漿也不能避免RNA的降解。更可靠的方法是：在液氮條件下將組織研碎，并且勻漿時(shí)使用更多裂解液。
3. 冷凍樣品：樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍，然后移至-70℃冰箱保存。樣品決不能未經(jīng)液氮速凍而直接保存于-70℃冰箱中。冷凍樣品，即使是冷凍細(xì)胞，如果不在液氮條件下研磨碎，而直接加入裂解液中勻漿，RNA也比新鮮樣品更容易降解。樣品在與裂解液充分接觸前決不能出現(xiàn)融化，所以研磨用具必須預(yù)冷，在碾磨過程中要及時(shí)補(bǔ)充液氮。樣品研碎后，在液氮?jiǎng)倓倱]發(fā)完時(shí)，將樣品迅速轉(zhuǎn)移到含裂解液的容器中，立即混勻勻漿。
4. 外源RNA酶的污染：試劑，器械及實(shí)驗(yàn)環(huán)境中的RNA酶進(jìn)入實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。
5. 內(nèi)源RNA酶的污染：抑制劑失效或者用量不夠，實(shí)驗(yàn)樣品過多；勻漿時(shí)溫度過高。