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詳解核酸分離純化的原理和步驟
核酸分離純化技術是生物化學與分子生物學的一項基本技術。隨著分子生物學技術廣泛應用于生物學、醫學及其相關等領域，核酸分離純化技術也得到進一步發展。各種新方法、經完善后的傳統經典方法以及商品試劑方法的不斷出現，極大地推動了分子生物學的發展。現就核酸分離與純化的原理及其方法學進展作一總結。
核酸分離純化的原則核酸在細胞中總是與各種蛋白質結合在一起的。核酸的分離主要是指將核酸與蛋白質、多糖、脂肪等生物大分子物質分開。在分離核酸時應遵循以下原則：保證核酸分子一級結構的完整性；排除其他分子污染。核酸分離純化的步驟大多數核酸分離純化的方法一般都包括了細胞裂解、酶處理、核酸與其他生物大分子物質分離、核酸純化等幾個主要步驟。每一步驟又可由多種不同的方法單獨或聯合實現。
1、細胞裂解：核酸必須從細胞或其他生物物質中釋放出來。細胞裂解可通過機械作用、化學作用、酶作用等方法實現。a. 機械作用：包括低滲裂解、超聲裂解、微波裂解、凍融裂解和顆粒破碎等物理裂解方法。這些方法用機械力使細胞破碎，但機械力也可引起核酸鏈的斷裂，因而不適 用于高分子量長鏈核酸的分離。有報道超聲裂解法提取的核酸片段長度從< 500bp ～ > 20kb 之間，而顆粒勻漿法提取的核酸一般< 10kb。b. 化學作用：在一定的p H 環境和變性條件下，細胞破裂，蛋白質變性沉淀，核酸被釋放到水相。上述變性條件可通過加熱、加入表面活性劑(SDS、Triton X-100 、Tween 20 、NP-40 、CTAB、sar-cosyl 、Chelex-100 等) 或強離子劑(異硫氰酸胍、鹽酸胍、肌酸胍) 而獲得。而p H 環境則由加入的強堿(NaOH) 或緩沖液 ( TE、STE 等) 提供。在一定的p H 環境下，表面活性劑或強離子劑可使細胞裂解、蛋白質和多糖沉淀，緩沖液中的一些金屬離子螯合劑( EDTA 等) 可螯合對核酸酶活性所必須的金屬離子Mg2+ 、Ca2+ ,從而抑制核酸酶的活性,保護核酸不被降解。c. 酶作用：主要是通過加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或鏈酶蛋白酶) 以使細胞破裂，核酸釋放。蛋白酶還能降解與核酸結合的蛋白質，促進核酸的分離。其中溶菌酶能催化細菌細胞壁(cell wall)的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸殘基間的β-(1 ,4) 鍵水解。蛋白酶K能催化水解多種多肽鍵，其在65 ℃及有EDTA、尿素(1～4mol/ L) 和去污劑(0. 5 %SDS 或 1 %Triton X-100) 存在時仍保留酶活性，這有利于提高對高分子量核酸的提取效率。在實際工作中,酶作用、機械作用、化學作用經常聯合使用。具體選擇哪種或哪幾種方法可根據細 胞類型、待分離的核酸類型及后續實驗目的來確定。
2、酶處理：在核酸提取過程中，可通過加入適當的酶使不需要的物質降解，以利于核酸分離純化。如在裂解液中加入蛋白酶(蛋白酶K 或鏈酶蛋白酶) 可以降解蛋白質，滅活核酸酶(DNase 和RNase)，DNase 和RNase 也用于去除不需要的核酸。
3、核酸分離純化：核酸的高電荷磷酸骨架使其比蛋白質、多糖、脂肪等其他生物大分子物質更具親水性，根據它們理化性質的差異，用選擇性沉淀、層析、密度梯度離心等方法可將核酸分離、純化。a. 酚提取/ 沉淀法：核酸分離的一個經典方法是酚∶氯仿抽提法。細胞裂解后離心分離含核酸的水相，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25 ∶24 ∶1 體積) 混合液。依據應用目的，兩相經漩渦振蕩混勻(適用于分離小分子量核酸) 或簡單顛倒混勻(適用于分離高分子量核酸) 后離心分離。疏水性的蛋白質被分配至有機相，核酸則被留于上層水相。酚是一種有機溶劑，預先要用STE 緩沖液飽和，因未飽和的酚會吸收水相而帶走一部分核酸。酚也易氧化發黃，而氧化的酚可引起核酸鏈中磷酸二酯鍵斷裂或使核酸鏈交聯；故在制備酚飽和液時要加 入82羥基喹嚀，以防止酚氧化。氯仿可去除脂肪，使更多蛋白質變性，從而提高提取效率。異戊醇則可減少操作過程中產生的氣泡。核酸鹽可被一些有機溶劑沉 淀,通過沉淀可濃縮核酸，改變核酸溶解緩沖液的種類以及去除某些雜質分子。典型的例子是在酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀，在含核酸的水相中加入p H5. 0～5. 5，終濃度為0. 3M 的NaOAc 或KOAc 后，鈉離子會中和核酸磷酸骨架上的負電荷，在酸性環境中促進核酸的疏水復性。然后加入2～2. 5 倍體積的乙醇，經一定時間的孵育，可使核酸有效地沉淀。其他的一些有機溶劑[ 異丙醇、聚乙二醇( PEG) 等]和鹽類(10. 0mol/ L 醋酸銨、8. 0mol/ L 的氯化鋰、氯化鎂和低濃度的氯化鋅等) 也用于核酸的沉淀。不同的離子對一些酶有抑制作用或可影響核酸的沉淀和溶解, 在實際使用時應予以選擇。經離心收集，核酸沉淀用70 %的乙醇漂洗以除去多余的鹽分，即可獲得純化的核酸。b. 層析法：層析法是利用不同物質某些理化性質的差異而建立的分離分析方法。包括吸附層析、親和層析、離子交換層析等方法在內的層析法。因分離和純化同步進 行,并且有商品試劑盒供應,而被廣泛應用于核酸的純化。在一定的離子環境下，核酸可被選擇性地吸附到硅土、硅膠或玻璃表面而與其他生物分子分離。另外一些 選擇性吸附方法以經修飾或包被的磁珠作為固相載體，磁珠可通過磁場分離而無需離心，結合至固相載體的核酸可用低鹽緩沖液或水洗脫。該法分離純化核酸，具有 質量好、產量高、成本低、快速、簡便、節省人力以及易于實現自動化等優點。玻璃粉或玻璃珠被證實為一種有效的核酸吸附劑。在高鹽溶液中， 核酸可被吸附至玻璃基質上，離液鹽碘化鈉或高氯酸鈉可促進DNA 與玻璃基質的結合。Dederich 等用酸洗玻璃珠分離純化核酸，獲得高產量的質粒DNA。在該方法中，細胞在堿性環境下裂解，裂解液用醋酸鉀緩沖液中和后，直接加至含異丙醇的玻璃珠濾板， 被異丙醇沉淀的質粒DNA 結合至玻璃珠，用80 %乙醇真空抽洗除去細胞殘片和蛋白質沉淀。后用含RNase A 的TE 緩沖液洗脫與玻璃珠結合的DNA，獲得的DNA 可直接用于測序。
核酸分離純化的原則核酸在細胞中總是與各種蛋白質結合在一起的。核酸的分離主要是指將核酸與蛋白質、多糖、脂肪等生物大分子物質分開。在分離核酸時應遵循以下原則：保證核酸分子一級結構的完整性；排除其他分子污染。核酸分離純化的步驟大多數核酸分離純化的方法一般都包括了細胞裂解、酶處理、核酸與其他生物大分子物質分離、核酸純化等幾個主要步驟。每一步驟又可由多種不同的方法單獨或聯合實現。
1、細胞裂解：核酸必須從細胞或其他生物物質中釋放出來。細胞裂解可通過機械作用、化學作用、酶作用等方法實現。a. 機械作用：包括低滲裂解、超聲裂解、微波裂解、凍融裂解和顆粒破碎等物理裂解方法。這些方法用機械力使細胞破碎，但機械力也可引起核酸鏈的斷裂，因而不適 用于高分子量長鏈核酸的分離。有報道超聲裂解法提取的核酸片段長度從< 500bp ～ > 20kb 之間，而顆粒勻漿法提取的核酸一般< 10kb。b. 化學作用：在一定的p H 環境和變性條件下，細胞破裂，蛋白質變性沉淀，核酸被釋放到水相。上述變性條件可通過加熱、加入表面活性劑(SDS、Triton X-100 、Tween 20 、NP-40 、CTAB、sar-cosyl 、Chelex-100 等) 或強離子劑(異硫氰酸胍、鹽酸胍、肌酸胍) 而獲得。而p H 環境則由加入的強堿(NaOH) 或緩沖液 ( TE、STE 等) 提供。在一定的p H 環境下，表面活性劑或強離子劑可使細胞裂解、蛋白質和多糖沉淀，緩沖液中的一些金屬離子螯合劑( EDTA 等) 可螯合對核酸酶活性所必須的金屬離子Mg2+ 、Ca2+ ,從而抑制核酸酶的活性,保護核酸不被降解。c. 酶作用：主要是通過加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或鏈酶蛋白酶) 以使細胞破裂，核酸釋放。蛋白酶還能降解與核酸結合的蛋白質，促進核酸的分離。其中溶菌酶能催化細菌細胞壁(cell wall)的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸殘基間的β-(1 ,4) 鍵水解。蛋白酶K能催化水解多種多肽鍵，其在65 ℃及有EDTA、尿素(1～4mol/ L) 和去污劑(0. 5 %SDS 或 1 %Triton X-100) 存在時仍保留酶活性，這有利于提高對高分子量核酸的提取效率。在實際工作中,酶作用、機械作用、化學作用經常聯合使用。具體選擇哪種或哪幾種方法可根據細 胞類型、待分離的核酸類型及后續實驗目的來確定。
2、酶處理：在核酸提取過程中，可通過加入適當的酶使不需要的物質降解，以利于核酸分離純化。如在裂解液中加入蛋白酶(蛋白酶K 或鏈酶蛋白酶) 可以降解蛋白質，滅活核酸酶(DNase 和RNase)，DNase 和RNase 也用于去除不需要的核酸。
3、核酸分離純化：核酸的高電荷磷酸骨架使其比蛋白質、多糖、脂肪等其他生物大分子物質更具親水性，根據它們理化性質的差異，用選擇性沉淀、層析、密度梯度離心等方法可將核酸分離、純化。a. 酚提取/ 沉淀法：核酸分離的一個經典方法是酚∶氯仿抽提法。細胞裂解后離心分離含核酸的水相，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25 ∶24 ∶1 體積) 混合液。依據應用目的，兩相經漩渦振蕩混勻(適用于分離小分子量核酸) 或簡單顛倒混勻(適用于分離高分子量核酸) 后離心分離。疏水性的蛋白質被分配至有機相，核酸則被留于上層水相。酚是一種有機溶劑，預先要用STE 緩沖液飽和，因未飽和的酚會吸收水相而帶走一部分核酸。酚也易氧化發黃，而氧化的酚可引起核酸鏈中磷酸二酯鍵斷裂或使核酸鏈交聯；故在制備酚飽和液時要加 入82羥基喹嚀，以防止酚氧化。氯仿可去除脂肪，使更多蛋白質變性，從而提高提取效率。異戊醇則可減少操作過程中產生的氣泡。核酸鹽可被一些有機溶劑沉 淀,通過沉淀可濃縮核酸，改變核酸溶解緩沖液的種類以及去除某些雜質分子。典型的例子是在酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀，在含核酸的水相中加入p H5. 0～5. 5，終濃度為0. 3M 的NaOAc 或KOAc 后，鈉離子會中和核酸磷酸骨架上的負電荷，在酸性環境中促進核酸的疏水復性。然后加入2～2. 5 倍體積的乙醇，經一定時間的孵育，可使核酸有效地沉淀。其他的一些有機溶劑[ 異丙醇、聚乙二醇( PEG) 等]和鹽類(10. 0mol/ L 醋酸銨、8. 0mol/ L 的氯化鋰、氯化鎂和低濃度的氯化鋅等) 也用于核酸的沉淀。不同的離子對一些酶有抑制作用或可影響核酸的沉淀和溶解, 在實際使用時應予以選擇。經離心收集，核酸沉淀用70 %的乙醇漂洗以除去多余的鹽分，即可獲得純化的核酸。b. 層析法：層析法是利用不同物質某些理化性質的差異而建立的分離分析方法。包括吸附層析、親和層析、離子交換層析等方法在內的層析法。因分離和純化同步進 行,并且有商品試劑盒供應,而被廣泛應用于核酸的純化。在一定的離子環境下，核酸可被選擇性地吸附到硅土、硅膠或玻璃表面而與其他生物分子分離。另外一些 選擇性吸附方法以經修飾或包被的磁珠作為固相載體，磁珠可通過磁場分離而無需離心，結合至固相載體的核酸可用低鹽緩沖液或水洗脫。該法分離純化核酸，具有 質量好、產量高、成本低、快速、簡便、節省人力以及易于實現自動化等優點。玻璃粉或玻璃珠被證實為一種有效的核酸吸附劑。在高鹽溶液中， 核酸可被吸附至玻璃基質上，離液鹽碘化鈉或高氯酸鈉可促進DNA 與玻璃基質的結合。Dederich 等用酸洗玻璃珠分離純化核酸，獲得高產量的質粒DNA。在該方法中，細胞在堿性環境下裂解，裂解液用醋酸鉀緩沖液中和后，直接加至含異丙醇的玻璃珠濾板， 被異丙醇沉淀的質粒DNA 結合至玻璃珠，用80 %乙醇真空抽洗除去細胞殘片和蛋白質沉淀。后用含RNase A 的TE 緩沖液洗脫與玻璃珠結合的DNA，獲得的DNA 可直接用于測序。