原子力激光共焦顯微鏡的主要原理是利用激光掃描束通過光柵針孔形成點光源，在熒光標記標本的焦平面上逐點掃描，采集點的光信號通過探測針孔到達光電倍增管，再經過信號處理，在計算機監視屏上形成圖像。對于物鏡焦平面的焦點處發出的光在針孔處可以得到很好的會聚，可以全部通過針孔被探測器接收。而在焦平面上下位置發出的光在針孔處會產生直徑很大的光斑，對比針孔的直徑大小，則只有極少部分的光可以透過針孔被探測器接收。而且隨著距離物鏡焦平面的距離越大，樣品所產生的雜散光在針孔處的彌散斑就越大，能透過針孔的能量就越少，因而在探測器上產生的信號就越小，影響也越小。正由于共焦顯微僅對樣本焦平面成像，有效的避免了衍射光和和散射光的干擾，使得它具有比普通顯微鏡更高的分辨率，并在生物學中獲得了廣泛的應用。
原子力激光共焦顯微鏡用激光作掃描光源，逐點、逐行、逐面快速掃描成像，掃描的激光與熒光收集共用一個物鏡，物鏡的焦點即掃描激光的聚焦點，也是瞬時成像的物點。系統經一次調焦，掃描限制在樣品的一個平面內。調焦深度不一樣時，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲于計算機內，通過計算機分析和模擬，就能顯示細胞樣品的立體結構。
在結構配置上，激光掃描共聚焦顯微鏡除了包括普通光學顯微鏡的基本構造外，還包括激光光源、掃描裝置、檢測器、計算機系統、圖像輸出設備、光學裝置和共聚焦系統等部分。由于該儀器具有高分辨率、高靈敏度、“光學切片”、三維重建、動態分析等優點，因而為基礎醫學與臨床醫學的研究提供了有效手段。此外，CLSM 對熒光樣品的觀察具有明顯的優勢，只要能用熒光探針進行標記的樣品就可用其觀察。
原子力激光共焦顯微鏡可以用于觀察細胞形態，也可以用于細胞內生化成分的定量分析、光密度統計以及細胞形態的測量, 配合焦點穩定系統可以實現長時間活細胞動態觀察。
在普通寬視野光學顯微鏡中，整個標本全部都被水銀弧光燈或氙燈的光線照明，圖像可以用肉眼直接觀察。同時，來自焦點以外的其他區域的熒光對結構的干擾較大，尤其是標本的厚度在 2um 以上時，其影響更為明顯。
激光共聚焦顯微鏡脫離了傳統光學顯微鏡的場光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源，激光束經照明針孔，經由分光鏡反射至物鏡，并聚焦于樣品上，對標本焦平面上每一點進行掃描。組織樣品中如果有可被激發的熒光物質，受到激發后發出的熒光經原來入射光路直接反向回到分光鏡，通過探測針孔時先聚焦，聚焦后的光被光電倍增管探測收集，并將信號輸送到計算機，處理后在計算機顯示器上顯示圖像。在這個光路中，只有在焦平面的光才能穿過探測針孔，焦平面以外區域射來的光線在探測小孔平面是離焦的，不能通過小孔。因此，非觀察點的背景呈黑色，反差增加，成像清晰。由于照明針孔與探測針孔相對于物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點同時聚焦于照明針孔與探測針孔，焦平面以外的點不會在探測針孔處成像，即共聚焦。以激光作光源并對樣品進行掃描，在此過程中兩次聚焦，故稱為激光掃描共聚焦顯微鏡。
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