檢測血液中水平的循環microRNA(miRNA)的能力對于研究液體活檢以監測進展(例如癥或抗性)很重要。關于miRNA的現有標準方法依賴于實時熒光定量PCR(qRT-PCR),其靈敏度和性高但無法直接檢測全血中的miRNA,需要對總RNA進行分離和純化,并且需要合成cDNA以測定miRNA的表達水平;是一項耗力、耗時的過程。對的血液樣品直接分析將使樣品損失小化并提供更和通用的測定。直接分析方法是很重要的,因為它們可以分離的RNA序列庫中的偏差,例如由于分離過程中RNA的片段化導致的提取物的低完整性。因此,需要可以直接檢測miRNA的臨床方法。
金涂覆的磁性納米顆粒(Au@MNP)作為一種可分散電極。其中,Au@MNP納米傳感器尋找分析物而不是分析物找到傳感界面,這被證明是解決納米級有限傳質速率的一種方法。使用Au@MNP作為可分散電極,與在傳統的金電極表面上使用相同的傳感策略相比,已被報道了檢測限和響應時間的過1000倍。
通過電場誘導的由探針DNA修飾的鍍金磁性納米顆粒(DNA-Au@MNP)網絡的重新配置,創建了的傳感器,用于直接分析與全血一樣復雜的樣品中的核酸。該傳感器是一個能夠在未加工的血液樣本中檢測從10aM到1nM的miRNA濃度的傳感器,檢測限為10aM。它可以區分生長的小鼠血樣中miRNA濃度的微小變化。
對于低檢測限的原因提出了兩點設想:一是雙鏈體的形成誘導DNA-Au@MNP之間距離的增加,了通過DNA-Au@MNP網絡的電子隧穿,其中存在有限數量的雜交納米傳感器來自DNA-Au@MNP網絡的電化學響應。二是利用電場對DNA-Au@MNP的磁性預組裝網絡進行極化,可能通過重新定向雜化納米傳感器,使其更接近電極表面,從而導致DNA-Au@MNP網絡向新的組裝體“重新配置”。當電場重構DNA-Au@MNP網絡,雜化DNA-Au@MNP數量增加時,這種現象作為一種放大機制,使得來自DNA-Au@MNP網絡的電化學電流受到更大的。隨后對這兩種設想進行了一一驗證,所得結果與假設一致。并探究了miRNA在細胞、外泌體、PBS緩沖液、50%的全血和未加工全血中的檢測,也較好。
圖1 提出的miRNA檢測傳感策略所涉及的步驟示意圖。(a)(b):用與靶miRNA(a)互補的亞甲基藍標記的探針DNA修飾的過量Au@MNP與樣品(b)混合;(c):30分鐘后,將Au@MNP與溶液磁性分離,洗去未雜交的序列;(d):Au@MNP(雜交和未雜交)磁性地收集在金微電極的表面上;(e):在雜交之前和之后獲得的穩定峰值電流用于測量目標分析物的量。
圖2 確定電化學測量合成miR-21濃度的靈敏度。(a)在將傳感器暴露于1pM合成miR-21溶液之前和之后獲得的方波伏安圖;(b)在將傳感器暴露于不同濃度的miR-21后雜交誘導的方波電流變化,通過連續稀釋摻入三種不同基質的合成miR-21的儲備溶液獲得:PBS(白色),健康人血清(灰色)和50%健康的人類血液(紅色)。
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