辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase,HRP）  比活性高，穩定，分子量小，純酶容易制備，所以常用。HRP分布于植物界，辣根中含量高，它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多個同工酶組成，分子量為40,000，等電點為pH3～9，酶催化的適pH因供氫體不同而稍有差異，但多在pH5左右。酶溶于水和58%以下飽和度硫酸銨溶液。HRP的輔基和酶蛋白吸收光譜分別為403nm和275nm，一般以OD403nm /OD275nm的比值RZ（德文Reinheit Zahl）表示酶的純度。度的酶RZ值應在3.0左右（可達3.4）。RZ值越小，非酶蛋白越多。HRP的測定對學和化學的研究以及臨床的診斷具有很重要的意義.

實驗
儀器和試劑  LKB-1250發光光度計；ModelSA 720酸度計;微量取樣器(50、100、200、500 uL);酶聯吸附板.Luminol溶液(5.0×10~3moL·dm~3):用0.1 moEdm-8NaHCOg-NaOH溶液容解配制;KI溶液: 2.0×10~3 moL-dm-3，HgO溶液:2.0×10-* moLdm3;HR溶液(1.0:10g-mL-1)、稱取100 mg HRP(RZ=2.5—3),溶解后,用蒸餾水稀釋至100 mL，4℃冰箱保存．使用時用蒸餾水逐級稀釋;HRP的乙型肝炎抗原和抗體等的標記物:HBsAg-HRP、HBsAb-HRP、HBoAb-HRP、PHSAR-HRP。
操作步驟  于26 mL容量瓶中先加入約10mL水后，加入1.0mL EDTA溶液(1.0 g·mL-1),2.5 nL2,0×10~3 moLdm-3KI溶液，2.5 mL 2.0×10~moL·dm-3Hg0浴液,用水稀釋至標線,搖勻備用.
用微量取樣器吸取上述溶液200 pL于酶聯吸附板中，加入100 pL HRP(或其標記物),室溫暗處放置20 min后,取此溶液100 puL放入LKB-1250發光光度計反應室，從儀器加液處加入500 uL5.0×10-3 moL·dm-3 Luminol，記錄反應所產生的光信號強度，同時作空白試驗后,繪制發光強度與HRP濃度間的關系曲線.
結果與討論
偶合反應的時間性質 偶合反應的速度受酶促反應速度和化學發光反應速度兩者影響,在堿性介質中，低濃度的碘氧化Luminol的化學發光反應屬于的雙電子氧化的一級反應2,其反應機理為

偶合反應的條件
酶促反應的pH值﹐研究了HR催化Hg0z氧化KI生成I的反應中p互值的影響，發現在pH3.5—3.7范圍內有較大的催化活性，而I2氧化Luminol的反應則以pH10為佳.

無論是測定游離HRP還是其標記物,利用偶合反應化學發光分析法測定的靈敏度均高于直接催化法,因而能很好地用于化學發光酶分析中。

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