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HPLC方法開發緩沖鹽的選擇
水相流動相的使用，是采用反相色譜法進行離子化合物分析檢測的關鍵步驟：包括pH值對分析物保留的影響、緩沖鹽的類型與濃度、緩沖鹽在有機溶劑中的溶解度及其對檢測的影響等。緩沖鹽種類、離子強度和pH值等選擇不當，會導致對極性化合物和可電離化合物進行反相分離時，存在不良或不可重現的保留和拖尾現象。
分析物部分離子化，分析物與固定相自由硅醇基和其他活性位點之間較強的作用力等問題，可通過選擇合適的緩沖范圍、正確的緩沖鹽種類及其濃度（離子強度）來改善。靈敏的LC-MS分析，更加注重酸、堿、緩沖鹽種類和其他添加劑的選擇：緩沖液不能抑制分析物的電離。
反相模式中，離子化合物的保留主要由流動相pH值來決定。離子官能團的解離性能同樣影響化合物的保留。非離子化合物的保留幾乎不受流動相pH值的影響。對于含酸性基團的化合物（羧酸鹽居多），pH值低于化合物pKa可增強保留，對于含堿性基團的化合物（胺類居多），pH值高于化合物pKa可增強保留。
在pH值離pka較遠的位置，較小的pH值變化對非質子-質子種類的比例影響很小。因此，中等pH值變化不會對保留產生明顯影響。pKa附近pH值的微小變化，會對兩種物質的比例產生明顯的影響。因此，改變接近pKa的pH值，會明顯影響化合物的保留。當pH值作為增加化合物保留的手段時，考慮方向應該是盡量降低分析物的離子化。緩沖液是弱酸與其共軛堿，或弱堿與其共軛酸的溶液。
緩沖液降低氫離子、水合氫離子和氫氧根離子的影響，從而較少包括稀釋在內的pH值波動。反相模式下，經典的硅膠基質填料的pH值耐受范圍是2-8。緩沖液的選擇通常由所需的pH值決定。緩沖液的pKa必須接近所需的pH值，因其在pKa處最容易控制pH值。經驗法則是選擇一個pKa值<2個單位的所需流動相pH的緩沖液。
緩沖鹽應用一般思路
1 | 緩沖鹽濃度一般為10-50mmol/L。根據樣品性質及進樣量選擇緩沖鹽濃度，使其滿足應有的緩沖能力。 |
2 | 梯度洗脫中有機相比例允許的最高值，應根據緩沖鹽與有機相混溶實驗確定。取不同緩沖鹽-有機相比例，確定有機相比例允許最高值，如緩沖鹽：有機相為10：90、20：80、30：70等不同比例。不得在儀器上隨意設置高比例有機相，以防緩沖鹽析出損壞儀器。 |
3 | 根據截止波長、pH值和緩沖能力等多個約束條件選擇緩沖鹽，如檢測波長在末端吸收，則一般應選用磷酸鹽。 |
4 | 常用緩沖鹽溶液有：0.1%磷酸/三氟yi酸/乙酸/甲酸溶液，0.02-0.05mol/L 磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調節pH至3.0）等。 |
5 | 堿性化合物優選鉀鹽，抑制拖尾效果更好。 |