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水相比例在HILIC模式下對(duì)分離有何影響？
HILIC模式中洗脫調(diào)整方向
洗脫原理主要是極性相似相容和親水分離分配模式，洗脫時(shí)極性強(qiáng)的溶劑越多，保留時(shí)間越短；出峰順序是極性弱的先出，極性強(qiáng)的后出，與反相相反，因此適合保留極性強(qiáng)，在反相上無(wú)法保留的物質(zhì)。
實(shí)例
CTP、ATP、GTP、UTP的分離：
ATP：三磷酸腺苷
GTP：三磷酸鳥(niǎo)苷
CTP：胞嘧啶核苷三磷酸
UTP：三磷酸尿苷
Ultimate® AQ-C18 4.6*250mm 5μm 磷酸鹽緩沖液（pH呈中性）-乙腈體系，梯度運(yùn)行見(jiàn)下表：
效果圖
分析：各峰分離良好，但出峰均在純鹽相段出峰，保留弱，部分目標(biāo)峰的峰型不好，方法重現(xiàn)性不好，易與溶劑峰重合。
根據(jù)HILIC的作用原理，該模式適合這類(lèi)極性物質(zhì)的分離，故Topsil® Silica 4.6*250mm 5μm：
磷酸鹽-乙腈（25/75）
分析: 四種物質(zhì)分離*，保留適中，但有雜質(zhì)峰干擾風(fēng)險(xiǎn)，峰形有可以?xún)?yōu)化的空間，減少水相，延長(zhǎng)保留。
磷酸鹽-乙腈（20/80）
分析：分離良好，峰形改善，雜質(zhì)無(wú)干擾，各目標(biāo)峰保留增強(qiáng)很多，一針運(yùn)行時(shí)間較長(zhǎng)，流動(dòng)相中水相比例對(duì)保留與分離影響較大，與HILIC的分離原理符合，水相為強(qiáng)洗脫能力項(xiàng)，微小比例的改變對(duì)色譜效果影響大，水相比例減小。
磷酸鹽-乙腈（22/78）
分析：與預(yù)期相一致，保留時(shí)間縮短，與雜質(zhì)能較好分離，可以嘗試梯度，在HILIC模式中水相的微小變化對(duì)色譜圖影響大，因此兩針之間的平衡時(shí)間建議在10倍柱體積以上，而且平衡時(shí)間一致，也可以讓系統(tǒng)達(dá)到一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，以保證分離效果的重現(xiàn)。
結(jié)論
運(yùn)行HILIC模式時(shí)：
1. 考慮樣品極性和溶解性：首先目標(biāo)一般是強(qiáng)極性物質(zhì)，且最好是在高比例有機(jī)相中有一定溶解性，如果樣品在有機(jī)相中不溶或溶解度很低，或容易產(chǎn)生其他反應(yīng)的，則不適用；
2. 考慮緩沖鹽與有機(jī)相的互溶性：調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例時(shí)，如果流動(dòng)相中含鹽，要考慮鹽在有機(jī)相中的溶解度，避免出現(xiàn)鹽析等現(xiàn)象；
3. 關(guān)注系統(tǒng)真正的平衡狀態(tài)：系統(tǒng)平衡不僅僅是關(guān)注基線噪音和漂移的問(wèn)題，是連續(xù)進(jìn)樣獲得穩(wěn)定的保留時(shí)間和峰面積，測(cè)試過(guò)程中會(huì)碰到系統(tǒng)平衡慢的問(wèn)題，需要附上解決或改善方法；
4. 關(guān)注樣品的穩(wěn)定性：確保所使用的樣品溶液是zui接近初始狀態(tài)的，測(cè)試過(guò)程中需關(guān)注溶液穩(wěn)定狀態(tài)，必要時(shí)臨用新制；根據(jù)整個(gè)方法時(shí)樣品的主峰情況確定最終的配制方法和保存方法。