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離子交換層析的緩沖液和鹽
緩沖液的pH和濃度
離子交換色譜通常至少會(huì)使用兩種不同的緩沖液：一種用于蛋白質(zhì)上樣并洗去不吸附的雜質(zhì)，稱為起始緩沖液；另一種用于洗脫吸附在柱上的蛋白質(zhì)，稱為洗脫緩沖液。
達(dá)到最終pH和鹽濃度的洗脫緩沖液稱為極限緩沖液。這里又分為兩種情況，在完成吸附后將目的蛋白洗脫下來(lái)有兩種方法：一種是通過(guò)改變pH，使蛋白質(zhì)的帶電狀態(tài)發(fā)生變化而不能結(jié)合在交換劑上，此方法會(huì)用到兩種不同pH的起始和洗脫緩沖液；另一種是通過(guò)增加離子強(qiáng)度，雖然不改變蛋白質(zhì)的帶電狀況，但高的離子強(qiáng)度會(huì)降低蛋白質(zhì)與離子交換劑之間的靜電引力，從而將蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)，此方法會(huì)用到兩種pH相同而離子強(qiáng)度不同的緩沖液，通常極限緩沖液是向起始緩沖液中添加特定濃度的鹽類而形成。
為了保證目的蛋白在吸附階段能結(jié)合到交換劑上，起始緩沖液的濃度一般比較低，介于0.01-0.05mol/L。但過(guò)低的起始濃度有可能造成蛋白質(zhì)在離子交換劑上吸附過(guò)于牢固而給洗脫造成困難，同時(shí)也應(yīng)當(dāng)控制吸附階段的時(shí)間。研究顯示，將蛋白質(zhì)吸附在離子交換柱上過(guò)夜再進(jìn)行洗脫，比直接進(jìn)行洗脫明顯困難，這是由于長(zhǎng)時(shí)間的吸附會(huì)引發(fā)蛋白質(zhì)的構(gòu)象緩慢發(fā)生改變，這種改變使之與交換劑結(jié)合更為牢固，并且這種構(gòu)象變化一般都會(huì)造成蛋白質(zhì)活性下降。合適的起始緩沖液濃度可以通過(guò)小樣試驗(yàn)確定。
在采用改變pH的方法洗脫時(shí)，洗脫緩沖液的緩沖成分種類往往與起始緩沖液相同，只是控制比例關(guān)系不同造成最終pH不同。洗脫緩沖液在濃度方面并沒(méi)有特殊的要求，常與起始緩沖液相同。在采用增加離子強(qiáng)度的方法洗脫時(shí)，所用洗脫緩沖液在緩沖物質(zhì)種類、pH和濃度上往往都與起始緩沖液相同，通常是通過(guò)向起始緩沖液中添加特定濃度的其他種類鹽 （如NaCl）來(lái)增加離子強(qiáng)度。
所以，實(shí)際上無(wú)論是何種緩沖液，緩沖物質(zhì)的濃度通常都不大，為了使其具有足夠的緩沖能力，必須滿足一定的條件。根據(jù)Henderson-Hasselbalch公式：
當(dāng)緩沖液的pH接近緩沖物質(zhì)的pKa時(shí)，才具有良好的緩沖能力。最大緩沖能力出現(xiàn)在pKa處，偏離pKa值1個(gè)pH單位緩沖能力將下降5倍。一般來(lái)說(shuō)，緩沖液的有效pH范圍約為pKa±2pH單位，而要獲得足夠強(qiáng)的緩沖能力，pH最好在pKa±0.5pH單位之間。當(dāng)弱酸（或弱堿）與對(duì)應(yīng)的鹽的物質(zhì)的量之比接近1:1時(shí)，此緩沖體系的緩沖能力*。所以在選擇緩沖液時(shí)，首先應(yīng)根據(jù)起始緩沖液所需要的pH，選擇pKa值與之接近的緩沖物質(zhì)，使弱酸（或弱堿）與對(duì)應(yīng)的鹽的物質(zhì)的量之比接近1。需要注意的是，緩沖物質(zhì)的pKa值是會(huì)隨溫度變化的，在溫度相差較大時(shí)會(huì)對(duì)溶液pH產(chǎn)生明顯的影響。例如，在室溫下配制出的Tris緩沖液比在冷藏室（4℃）中的低0.05個(gè)pH單位。
離子對(duì)色譜行為的影響
采用增加離子強(qiáng)度的方法洗脫蛋白質(zhì)時(shí)，通常選用某種非緩沖鹽類，zui常用的是NaCl，添加到起始緩沖液中，構(gòu)成了洗脫緩沖液。在進(jìn)行色譜分離時(shí)，洗脫緩沖液中的緩沖物質(zhì)固然會(huì)影響到色譜效果，實(shí)際上非緩沖鹽的種類和性質(zhì)同樣會(huì)影響到色譜時(shí)的分辨率和選擇性，使用不同的非緩沖鹽離子時(shí)，可能造成不同物質(zhì)被洗脫的先后順序發(fā)生變化，因此非緩沖鹽的選擇同樣具有重要意義。
在前面離子交換理論部分討論過(guò)，價(jià)態(tài)高的離子與交換劑的結(jié)合力更強(qiáng)，所以一般情況下，多價(jià)離子是比一價(jià)離子更好的置換離子，它們能使蛋白質(zhì)比較早被洗脫下來(lái) （保留值小）。所以在陽(yáng)離子交換劑上，蛋白質(zhì)的保留值與置換離子的關(guān)系為：Ba2+＜Ca2+＜Mg2+＜NH4+＜K+＜Na+＜Li+，但也存在例外，比如對(duì)于溶菌酶來(lái)說(shuō)，NH4+是比Mg2+更有效的置換離子。在選擇置換離子時(shí)，應(yīng)當(dāng)考慮到多方面的因素，強(qiáng)的置換離子能有效縮短色譜時(shí)間，但往往也降低蛋白質(zhì)回收率。一般情況下選擇置換能力居中的鹽離子較為合適，在洗脫與交換劑牢固結(jié)合的蛋白質(zhì)時(shí)，選用強(qiáng)的置換離子具有優(yōu)勢(shì)。
不但置換離子，洗脫鹽中與功能基團(tuán)帶同種電荷而不參與離子交換過(guò)程的離子也會(huì)影響到蛋白質(zhì)的色譜行為，原因也有多種。有些是因?yàn)殡x子與蛋白質(zhì)發(fā)生作用導(dǎo)致的。此外，二價(jià)離子如Ca2+和Mg2+能與蛋白質(zhì)分子中的酰胺基形成復(fù)合物而影響到其色譜行為。
總之，離子對(duì)色譜行為的影響是多方面的，沒(méi)有一定的規(guī)律。在首ci進(jìn)行色譜分離時(shí)，可優(yōu)先選擇比較通用的一些緩沖物質(zhì)和鹽類，在此基礎(chǔ)上再進(jìn)一步優(yōu)化。
添加劑
在有些情況下，在進(jìn)行離子交換時(shí)還會(huì)添加一些其他的化合物，其作用主要有：增加蛋白質(zhì)的溶解度，提高色譜分辨率，保護(hù)待分離物質(zhì)等。大多數(shù)蛋白質(zhì)是溶于水的，但也有部分蛋白質(zhì)疏水性比較強(qiáng)，在水中的溶解度很小，這使得色譜操作難于實(shí)現(xiàn)。具體例子是膜蛋白的分離。膜蛋白存在于生物膜中，其表面是疏水區(qū)，與生物膜中疏水性的脂質(zhì)成分以疏水相互作用結(jié)合，這類蛋白在水中是不溶的或溶解度很低。向溶液中添加非離子型或兼性離子型去污劑可以使膜蛋白溶解并分散在水溶液中，便于色譜的進(jìn)行。有機(jī)溶劑（如氯仿、甲醇等）也能增加疏水性蛋白質(zhì)的溶解度，而且由于有機(jī)溶劑降低溶液的介電常數(shù)，使得蛋白質(zhì)與交換劑之間的靜電作用力更強(qiáng)，吸附更為牢固。
某些情況下，添加特定的物質(zhì)還能提高色譜時(shí)的分辨率。例如，在分離一些蛋白質(zhì)時(shí)，添加甜菜堿或牛磺酸能減少蛋白聚集體的形成及其與交換劑的結(jié)合，從而提高了分辨率。有的中性聚合物如聚乙二醇（PEG）能與蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)溶液中的水分子，這將增加蛋白質(zhì)與離子交換劑的相互作用而提高分辨率。分離過(guò)程中有時(shí)還需添加酶抑制劑。例如在蛋白質(zhì)分離過(guò)程中，樣品體系中如果有蛋白酶存在，會(huì)造成目的蛋白被水解，使回收率下降，添加蛋白酶抑制劑能夠有效保護(hù)目的蛋白。絲氨酸蛋白酶常用的抑制劑是苯甲huang酰氟，巰基蛋白酶常用的抑制劑是碘乙酰胺，金屬蛋白酶可采用金屬螯合劑作為抑制劑。