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凝膠柱的選擇與凝膠的預處理
凝膠柱的選擇
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在選擇凝膠柱時，從外觀、質地結構和性能來講，所選柱子要透明光滑，內徑一致，耐壓防腐，柱子物料須生物兼容，并有良好的物理化學抗性和穩定性。一般的柱材料多為玻璃或有機玻璃，在使用鋼柱時，特別要注意防腐蝕。另外，柱子終端要有采集器和過濾網，柱底板要求耐壓且不容易堵塞。死體積應小于0.001Vt，如果死體積過大，被分離組分可能會重新混合，導致洗脫峰出現拖尾現象，降低分辨率。底板過濾介質要求新，且帶有能與凝膠融合的網孔，避免接觸網孔和過濾介質的表面，因為指紋會使樣品的分離程度下降。在裝柱或重新裝柱時，所有部位必須*清洗干凈。
凝膠柱的長度和內徑主要取決于加樣體積的多少和對分辨率的要求。凝膠柱的長度對分辨率的影響較大，長柱的分辨率要比短柱的高，但過長會引起柱內不均一、liu速過慢，柱長度一般不超過100cm。同時，也要有適當的柱內徑，內徑過粗會產生蛋白樣品較為嚴重的橫向擴散現象，內徑過細，靠近柱內壁的流速會大于中心的流速，產生“器壁效應"，影響分離速度和效果。通常使用的凝膠柱長度在25-70cm，內徑在4-16mm，H/D（高徑比）一般在 （25:1）-（100:1）之間。用于組別分離的凝膠柱，其H/D 可相對低一些；進行分級分離時H/D可在（30:1）-（100:1）；而脫鹽柱由于對分辨率的要求較低，一般用短柱，H/D大多在（5:1）-（25:1）之間。如果要分離的蛋白質分子量相差較大，可選用H/D=（15:1）-（50:1）的柱子，且柱體積要大于4-15倍的樣品體積；如要分離的蛋白質分子量差異較小，則選用H/D=（20:1）-（100:1）的細柱，且柱體積要大于25-100倍的樣品體積。在純化蛋白質時，為了得到較好的分辨率，柱子的H/D 應在（20:1）-（40:1）。
此外，選擇柱子時還應考慮凝膠顆粒的大小。如填裝小顆粒凝膠，適合使用較大直徑的色譜柱；用粗顆粒填裝時，則用較小直徑的柱子。
凝膠的預處理
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市售凝膠一般呈干粉顆粒狀（如 Tandex） 或水懸浮狀 （如Tanrose CL）。一些不宜在脫水干燥狀態下保存的凝膠 （如瓊脂糖凝膠），應存放在含防腐劑的水溶液中，這些凝膠在使用前不需要進行溶脹處理。另外，多孔硅膠和多孔玻璃也不需要溶脹處理。為了盡量減少不同溶劑對柱床體積的影響，獲得理想的分離效果，應將干膠緩慢倒入5-10倍干膠體積的洗脫液中充分溶脹。若溶脹不夠，則達不到有效的分離，而且在使用過程中會引起凝膠柱破裂。
根據蛋白質樣品的分子量和分辨率要求選擇好所用凝膠的類型后，再根據柱體積和凝膠的吸水性質估算出干膠的用量。由于凝膠在預處理和實驗操作過程中有一定量的損失，所以在實際稱取時應高于理論計算值的10%-20%。
不同類型的凝膠所需的溶脹時間不同。一般型號較小、排阻極限較低的凝膠，其吸水量較低，溶脹所需時間較短，在20℃條件下需3-4h即可；型號較大、排阻極限較高的凝膠，其吸水量較大，故所需的溶脹時間也較長，在20℃左右需十幾小時到幾十小時。
加熱溶脹是常用的凝膠預處理方法，即把所稱量的凝膠干粉溶在洗脫液中逐漸加熱至接近沸騰。這種方法可大大縮短溶脹時間，一般在1-2h內即可完成，而且可起到溶脹、除氣和殺菌的三重效果。在凝膠溶脹過程中要不斷緩慢攪拌，但不能劇烈攪拌，因為這樣容易引起凝膠顆粒的破碎，最終使細小顆粒堵塞凝膠柱而影響到流速和分離效果。此外，還應盡量避免在酸或堿中進行加熱溶脹，以防破壞凝膠的網孔結構。
待充分溶脹后，應將凝膠勻漿懸浮，看上清中是否有雜質或不均一的細小顆粒，如有則需反復傾倒去除，直至上清液不再渾濁為止。對溶脹后的凝膠進行除氣泡是非常重要的，否則也會影響分離效果，一般可通過真空抽氣或加熱煮沸的方法排除氣泡。由于凝膠價格昂貴，在使用過程中要盡量減少損失和浪費，剩余凝膠要保存好，以備后用。