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親和色譜分離技術(shù)
親和色譜分離技術(shù)
親和色譜分離技術(shù)是專門用于純化生物大分子的色譜分離技術(shù)，它是基于固定相的配基與生物分子間的特殊生物親和能力來進(jìn)行互相分離的。
親和色譜廣泛用于酶、抗體、核酸、激素等生物大分子，以及細(xì)胞、細(xì)胞器、病毒等物質(zhì)的分離與純化。特別是對分離含量極少而又不穩(wěn)定的活性物質(zhì)*，經(jīng)一步親和色譜即可提純幾百至幾千倍。例如，從肝細(xì)胞抽提液中分離胰島素受體時，以胰島素為配基，偶聯(lián)于瓊脂載體上，采用親和色譜可提純8000倍。親和色譜經(jīng)過幾十年的發(fā)展，隨著新型介質(zhì)的應(yīng)用和各種配體的出現(xiàn)，其應(yīng)用日益廣泛。
親和色譜原理
親和色譜的吸附作用主要是靠生物分子對它的互補(bǔ)結(jié)合體（配基）的生物識別能力，如酶與底物、抗原與抗體、激素與受體、核酸中的互補(bǔ)鏈、多糖與蛋白復(fù)合體等。親和色譜是應(yīng)用生物高分子物質(zhì)能與相應(yīng)專一配基分子可逆結(jié)合的原理，將配基通過共價(jià)鍵牢固地結(jié)合于固相載體上，制得親和吸附系統(tǒng)。生物分子上具有特定構(gòu)象的結(jié)構(gòu)域與配體的相應(yīng)區(qū)域結(jié)合，具有高度的特異性和親和性。其結(jié)合方式為立體構(gòu)象結(jié)合，具有空間位阻效應(yīng)。結(jié)合的作用力包括靜電作用、疏水作用、范德瓦耳斯力以及氫鍵等。
例如，酶和底物的專一結(jié)合，被假設(shè)為是一種“多點(diǎn)結(jié)合"，底物分子中至少有3個官能團(tuán)應(yīng)與酶分子的各個對應(yīng)官能團(tuán)結(jié)合，而且這種結(jié)合必須持有特定的空間構(gòu)型。也就是說，底物分子中的一些官能團(tuán)必須同時保持著與酶分子中相應(yīng)官能團(tuán)起反應(yīng)的構(gòu)型。如果某個有關(guān)基團(tuán)的位置發(fā)生改變，就不可能再有結(jié)合反應(yīng)出現(xiàn)。
將具有特異親和力的一對分子的任何一方作為配基，在不傷害其生物功能的情況下，與不溶性載體結(jié)合，使之固定化，裝入色譜柱中，然后將含有目的物質(zhì)的混合液作為流動相，在有利于固定相配基與目的物質(zhì)形成配合物的條件下進(jìn)入色譜柱。這時，混合液中只有能與配基發(fā)生配位反應(yīng)形成配合物的目的物質(zhì)被吸附，不能發(fā)生配位反應(yīng)的雜質(zhì)分子直接流出。經(jīng)清洗后，選擇適當(dāng)?shù)南疵撘夯蚋淖兿疵摋l件進(jìn)行洗脫，使被分離物質(zhì)與固定相配基解離，即可將目的產(chǎn)物分離純化。
親和色譜分離操作過程
親和色譜分離的基本過程如下：
把具有親和力的一對分子的任何一方作為配基，在不傷害其生物功能的情況下，與不溶性載體結(jié)合，使之固化，裝入色譜柱，然后把含有目的物質(zhì)的混合液作為流動相，在有利于固定相配基和目的物形成配合物的條件下進(jìn)入色譜柱。這時，混合液中只有能與配基發(fā)生結(jié)合反應(yīng)形成配合物的目的物質(zhì)被吸附，不能發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的雜質(zhì)分子則直接流出。變換通過色譜柱的溶液組成，促使配基與其親和物解離，即可獲得純化的目的產(chǎn)物。
親和色譜分離技術(shù)的應(yīng)用
親和色譜分離技術(shù)由于其具有簡便、快速、專一和高效等特點(diǎn)，已普及到生命科學(xué)各個領(lǐng)域，在生物制品分離和分析領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用開發(fā)前景。親和色譜主要用來純化生物大分子，適用于從組織或發(fā)酵液中，分離雜質(zhì)與純化目的物間溶解度、分子大小、電荷分布等物化性質(zhì)差異較小，而相對含量低、其他經(jīng)典手段分離有困難的高分子物質(zhì)。尤其是對分離某些不穩(wěn)定的高分子物質(zhì)更具*性。
1）分離和純化各種生物分子
親和色譜可以用來分離與純化干擾素、酶、rDNA、抗原、抗體、絨毛生長激素等各種生物分子。例如，用親和色譜純化干擾素，可以一步把人體纖維母細(xì)胞干擾素純化數(shù)千倍，分離效guo顯著。
2）分離純化各種功能細(xì)胞、細(xì)胞器、膜片段和病毒顆粒
親和色譜為分離和純化不同功能的細(xì)胞提供了可能性。
3）用于各種生物物質(zhì)的分析檢測
親和色譜技術(shù)在生物物質(zhì)的分析檢測上也已廣泛應(yīng)用。例如，利用親和色譜可以檢測羊抗DNP（二硝基苯）抗體。