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全面解析GST 親和層析
概述
谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）是生物體內的一類重要的代謝酶，參與外源和內源有毒物質的代謝。GST通過催化還原型的谷胱甘肽（GSH）和有毒物質偶聯反應，使有毒化合物的水溶性增加從而更容易排出體外，最終達到解毒的作用。利用這個原理，將GST做成標簽表達出融合蛋白，與帶谷胱甘肽配基的親和介質特異性結合，從而純化出目標蛋白，再用特異性的酶將GST標簽切除從而得到天然蛋白。
GST標簽
GST標簽是一種常見的標簽，它能夠增加外源蛋白的可溶性，很好地保留了蛋白的抗原性和生物活性，可在不同的宿主中表達，適應范圍廣，能夠提高外源蛋白的穩定性，可用不同的蛋白酶去除且具有高特異性，純化方便、溫和。但它也有一定的缺點，比如分子量較大，可能會影響蛋白質的功能和下游實驗，因此純化后需要去除標簽，并且如果蛋白不可溶，很難用變性的方法純化。
GST親和層析
GST親和層析是利用GST融合蛋白與固定的谷胱甘肽（GSH）通過硫鍵共價結合，通過GSH交換洗脫的原理來進行純化。該純化柱中，凝膠手臂上通過硫鍵結合一個GSH，然后利用其與GST-tag之間酶和底物的特異性作用力，使得帶GST標簽的融合蛋白能夠與凝膠上的GSH結合，從而將標簽蛋白與其他蛋白分離開。
月旭GST親和層析填料
GST融合蛋白純化步驟
1.將GST Tanrose 4FF裝入合適的層析柱，層析用5倍柱體積的結合Buffer進行平衡，使填料處于與目的蛋白相同的緩沖體系下，起到保護蛋白的作用。
2.將樣品加到平衡好的GST Tanrose 4FF中（保證目的蛋白與GST Tanrose 4FF充分接觸，提高目的蛋白的回收率），收集流出液。
3.用10-15倍柱體積的洗雜Buffer進行清洗，去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜液。
4.使用5-10倍柱體積的洗脫Buffer，收集洗脫液，即目的蛋白組分。
5.依次使用3倍柱體積的結合Buffer和5倍柱體積的去離子水平衡填料，最后再用5倍柱體積的20%的乙醇平衡，然后保存在等體積的20%的乙醇中，置于4度保存，防止填料被細菌污染。
應用實例
層析柱：PreCot 5mL GST 4FF；
樣品：重組表達GST標簽蛋白；
結合緩沖液：20mM PB，150mM NaCl，pH7.4；
洗脫緩沖液：15mM還原型谷胱甘肽，50mM Tris pH8.0。
常見問題解答
GST蛋白結合效率低，該怎么辦？
可能原因：上樣流速太快，結合時間太短。
解決方法：降低流速，保證足夠的結合時間
可能原因：緩沖液不合適，柱子平衡不到位。
解決方法：將緩沖液pH控制在3-12之間，用至少5倍的柱體積平衡柱子。
可能原因：樣品中GST融合蛋白濃度太低。
解決方法：先濃縮樣品，再進行純化。
可能原因：GST蛋白發生變性或聚集。
解決方法：選擇合適的細胞破碎方式；發生聚集時可嘗試添加1-10mM的DTT促進蛋白溶解；GST蛋白與核酸結合或蛋白之間結合時可添加適量NaCl（100-300mM）。
GST蛋白洗脫困難，該怎么做？
可能原因：洗脫強度不夠。
解決方法：增加洗脫體積數；調整洗脫緩沖液pH（8-9）或離子強度（100-300mM氯化鈉）。
可能原因：非特異性吸附。
解決方法：洗脫緩沖液中加入1%-2%Triton X-100。
可能原因：洗脫緩沖液中的谷胱甘肽被氧化了。
解決方法：洗脫緩沖液需現配現用，也可嘗試加入1-5mM的DTT。
GST蛋白純化后純度太低，該怎么做？
可能原因：GST融合蛋白降解。
解決方法：加入蛋白酶抑制劑防止降解。
可能原因：在宿主細胞內表達過程中GST標簽脫落。
解決方法：嘗試更換宿主細胞或者優化序列。