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影響凝膠色譜分離的因素
凝膠的選擇
各種凝膠在結構上是很相似的，都是三維空間網狀交織的高分子聚合物。分離程度主要取決于凝膠顆粒內部微孔的孔徑和混合物的分子量這兩個因素。微孔孔徑的大小與凝膠物質中凝膠濃度的平方根呈反比，與凝膠聚合物分子的平均直徑呈正比（其聚合物分子近似地當做球形）。和凝膠孔徑直接關聯的是凝膠的交聯度，交聯度越高，孔徑越??；反之，孔徑就大。移動緩慢的小分子物質，在低交聯度的凝膠上不容易分離，大分子同小分子物質的分離也宜用高交聯度的凝膠。葡聚糖凝膠的交聯度隨每克干燥凝膠的吸水量的增加而遞減。
洗脫液流速
根據具體實驗情況決定洗脫液的流速，一般采用30~200mL/h。流速過快會使色譜帶變形，影響分離效果，流速的調節可采用靜液壓法裝置。
洗脫液的離子強度和pH
非水溶性物質的洗脫，采用有機溶劑，水溶性物質的洗脫，一般采用水或具有不同離子強度和pH的緩沖液。離子強度的變化，對于物質的分離有不同的影響。在洗脫堿性蛋白時，洗脫劑中必須含有一定濃度的無機鹽，而且隨著鹽濃度的增加，移動加快。pI低于7的蛋白質的洗脫，很少受離子強度變化的影響。在酸性pH時，堿性物質易于洗脫。多糖類物質洗脫以水最佳。
上樣量
凝膠色譜很少用在分離純化的開始階段。為了達到良好的分離效果，柱子的上樣量必須保持較小的體積。對于蛋白質來說，上樣量通常為柱體積的2%~5%。樣品中含有雜質太多時就有可能堵塞柱子。凝膠色譜通常用在分離純化的最后階段，此時的目的產物已經比較純，濃度較高。樣品加到色譜柱后，選用合適的洗脫液進行洗脫，通常目的產物被稀釋很多倍。
柱的選用
凝膠色譜技術一般要求有較長的柱子。例如，用凝膠色譜分離蛋白質，柱子的長度通常為內徑的25~40倍。工業規模的凝膠過濾色譜還可用疊積柱系統，這種系統把凝膠介質分別裝入同樣大小的、短粗的色譜柱，然后再將這些柱子垂直地連成一套，柱子之間的連接距離控制到最小。這個系統的分離效果與只使用一根柱子一樣，但凝膠所承受的壓力要低得多。此外，如果這個系統中的一根柱子發生堵塞（通常是最上面的一根），可以很方便地拆下來更換另一根新柱子。
