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Anti-Flag瓊脂糖凝膠Anti-Flag Affinity Gel可以實現高效快速的抗原分離。免疫沉淀試劑盒配有經過優化預制的緩沖液，為免疫沉淀實驗提供了最佳的反應條件，增強了免疫沉淀實驗的穩定性。本產品可廣泛應用于細胞裂解物、細胞分泌上清、血清、腹水等樣品中抗原的免疫沉淀反應。

訂購信息

常溫運輸。4℃保存，有效期24個月。

技術參數

貼壁細胞樣品

1.移去培養基，用PBS洗細胞兩次。

2.收集細胞至1.5 mLEP 管內，按比例加入IP Lysis/Wash Buffer，同時加入PMSF等相應的抑制劑，混勻后置于冰上靜置5-20 min（期間混勻幾次）。

3.4 ℃, 12000-16000 g,10 min離心收集上清液，置于冰上以備后續實驗（或置于-80 ℃長期保存）。

培養皿IP Lysis/Wash Buffer推薦使用體積：

懸浮細胞樣品

1.4℃、500-1000 g、10 min，收集細胞，棄上清。

2.用PBS 洗細胞一次，即用PBS 將細胞團重懸，4℃、500-1000 g、10 min，收集細胞，棄上清。

3.用預冷的IP Lysis/Wash Buffer重懸細胞。每50 mg 細胞使用500μL IP Lysis/Wash Buffer。同時加入PMSF等相應的抑制劑，混勻后置于冰上靜置5-20 min（期間混勻幾次）。

4.4 ℃, 12000 -16000 g,10 min離心收集上清液，置于冰上以備后續實驗（或置于-80 ℃長期保存）。

血清樣品

　一般建議建議用IP Lysis/Wash Buffer稀釋血清樣品至目標蛋白終濃度為50~150 µg/mL，置于冰上備用（或置于-20 ℃長期保存）。

免疫沉淀

【注】：為保證凝膠均勻分布，使用前通過反復顛倒或輕微渦旋混勻瓶中凝膠。

1.將25 µL的Anti-Flag Affinity Gel加入1.5 mL 離心管中。

2.向凝膠中加入500 µL 預冷PBS，輕柔混勻。

3.將離心管放入離心機中1000rpm，5min收集凝膠到離心管的底部，去除上清。

4.向離心管中加入200-500 µL IP Lysis/Wash Buffer。顛倒離心管數次或輕微渦旋混勻1 min。將離心管放入離心機中1000rpm，5min收集凝膠到離心管的底部，去除上清。

5.將制備好含有Flag標記蛋白的樣品加入裝有凝膠的離心管中，保持混勻室溫下孵育2-4 h。

6.離心1000rpm，5min收集凝膠，除去未結合的樣品，保存以備分析。

7.向離心管中加入500 µL IP Lysis/Wash Buffer，輕柔混勻。收集凝膠，棄上清。再重復洗兩次。

8.變性洗脫：向離心管中加入80-100 µL SDS-PAGE Sample Loading Buffer（1×），將樣品置于100℃水浴或者金屬浴中加熱10 min。通過磁力架分離磁珠，保留含有目的抗原的上清。

【注】：如需保持蛋白活性，也可采用以下洗脫方式。

低pH洗脫：向離心管中加入100 µL Elution Buffer。保持混勻在室溫下孵育離心管5-10 min。通過離心分離凝膠，保留含有目的抗原的上清。每100 µL洗出液中加入20 µL Neutralization Buffer來中和低pH。

注意事項

1.本產品僅限于科學實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領域。

2.請勿高速離心、干燥或冷凍凝膠，這些操作會導致凝膠聚集而降低結合能力。

3.IP實驗中不同類型的抗體與抗原結合的親和性是有區別的，抗體與抗原結合還會受到IP Lysis/Wash Buffer的影響，因此，如使用本實驗步驟不能獲得最佳的實驗結果，可自行優化操作細節或者篩選及配制緩沖液進行實驗，推薦使用李記生物的相關產品，參照相關產品推薦。

4.微球使用前應充分振蕩均勻。微球應保存在儲存溶液中，防止干燥。

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