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產品描述

間充質干細胞無血清培養基是一款無外源動物成分的人間充質gan細胞培養基。可應用于人臍帶組織來源的干細胞的原代分離、擴增與傳代培養，并保持其多向分化潛能。本產品內毒素水平遠低于中國藥典標準，生產過程遵循ISO9001 體系,并符合GMP 指導原則。

間充質干細胞無血清培養基主要成分：氨基酸，維生素、無機鹽、白蛋白，轉鐵蛋白、胰島素、微量元素，細胞因子等。主要用于人臍帶來源的干細胞原代分離、擴增與傳代培養。

訂購信息

產品組分

運輸與保存

干冰運輸。組分A在4℃保存，組分B在-20℃保存，混合后4℃保存，有效期12個月。

使用方法

間充質干細胞無血清培養基配制

1. 37℃快速解凍組分B，快速溶解時不易破壞添加劑中營養物質，時間大致為10min。待添加劑融化后搖勻，分裝或直接按比例添加到基礎培養基中，分裝后添加劑立即儲存于-20℃至-80℃，避免反復凍融。

2. 將組分B以10%比例加入到組分A中，混勻，即為間充質干細胞無血清培養基。混合后培養基可在4℃ 穩定儲存2-3 周，不建議使用已配制超過3 周的培養基。

3. 間充質干細胞無血清培養基可直接應用于人類臍帶組織來源的干細胞的原代分離、擴增與傳代培養。

4. 預先高溫高壓滅菌處理剪刀，鑷子等實驗器械。

5. 預先紫外滅菌超凈臺/安全柜等實驗環境。

【注】以下步驟皆應在無菌條件下操作：

1. 間充質干細胞原代分離（貼壁法）

臍帶簡介：臍帶包括臍帶血、華通氏膠、兩根動脈、一根靜脈，所有這些結構被臍帶上皮（內襯膜）包裹。臍帶是間充質干細胞的主要來源，其中華通氏膠只含有間充質干細胞一種干細胞，是常用來分離培養間充質干細胞的結構。而內襯膜則含有至少兩種干細胞：間充質干細胞和上皮干細胞，這兩種干細胞也是細胞治療的主要來源。以下方法為從華通氏膠中分離高純度的間充質干細胞詳細步驟：

1.1. 無菌收集長度約10cm 的臍帶，迅速將臍帶放到含有人臍帶脂肪保存液的50mL離心管中。在4℃條件下快速運到實驗室，在4h 內處理完成全部過程。

1.2. 將臍帶置于生物安全柜中冰盒里放置的直徑10cm 培養皿中。用預冷的PBS 多次清洗臍帶，去除殘留的血液即止。以下分離組織塊的過程確保全程臍帶浸泡在預冷PBS 中保持濕潤。

1.3. 使用剪刀徑向剖開臍帶，將血管以及周圍的華通氏膠暴露出來。

1.4. 用解*刀將華通氏膠與血管分離，用鑷子夾住血管，整條剝離，中間白色部分即華通氏膠（具體人類臍帶結構參見圖1）。

1.5. 用剪刀將華通氏膠剪成0.5-1cm 見方的薄片組織塊，盡量不要太厚。最后剩余的臍帶上皮（內襯膜）組織棄除。

注意：組織塊盡量接近片狀，增大與培養皿接觸面積，提高細胞爬出率

1.6. 每個直徑10cm 的培養皿中放置10-15 個組織塊，加入6mL 完培養基。置于37℃，5%CO2培養箱中培養不同原代分離體系初始組織塊數量以及細胞爬出率見表1。

注意：①為促進組織塊貼壁，培養基不能加太多，否則組織塊容易漂起 ②為促進組織塊貼壁，72 小時內不能搖晃培養皿，72 小時第一次換液也是同理。

表1.臍帶組織塊粘壁數據（平均數據）

1.7. 每72 小時換液。一般5-7 d可以看見貼壁組織塊附近有細胞爬出，12-15 d細胞匯合度達到70%以上，即可準備傳代。

1.8. 細胞傳代時，用槍頭吸掉組織塊以及原有培養基，加入5mL PBS 清洗一次。每個直徑10mL，的培養皿中加入5mL 的細胞消化液，搖勻覆蓋皿底，37℃恒溫箱2-3min 或室溫3-5min 孵育。

1.9. 顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開始脫離皿底，輕輕敲打皿底，細胞呈細沙狀脫落，加入同體積完培養基，用移液槍扇形吹打使細胞完脫落下來，將細胞懸液收集到15mL 離心管中，300×g離心5min。

1.10. 用完培養基重懸、計數，此時的細胞稱為P0 代。相關代次預期收獲細胞量請參考表2。

1.11. 根據本公司統計數據，10cm 長的臍帶，約可以收獲1.24×107 個P0 代細胞，一根臍帶長度大約20cm，約可以收獲2.5×107 個P0 代細胞。

1.12. 根據本公司檢測，按1:8 傳代，細胞形態在P10 代內不發生變化。P10 代以上細胞沒有實際應用意義，暫不檢測。

1.13. 臍帶兩端的組織原代分離效率有較大差異，近胎盤端分離效率要高于近胎兒端10-30%。

表2.10cm 長的臍帶P0-P5 代預計收獲細胞數量（1:8 傳代）

2. 間充質干細胞傳代培養

2.1. 在顯微鏡下觀察細胞，細胞匯合度達到90%，即可準備傳代;

2.2. 吸掉培養瓶/皿中的培養基，用PBS 清洗一次，加入適量的細胞消化液（AC-1001024）覆蓋瓶/皿底，37℃恒溫箱2-3min 或室溫3-5min 孵育。

2.3. 顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開始脫離瓶/皿底，輕輕敲打瓶/皿底，細胞呈細沙狀脫落，加入等倍體積的完培養基，用移液槍扇形吹打使細胞脫落下來，并輕輕吹打成單細胞，將細胞懸液收集到適當的離心管中，室溫300×g 離心5min。

2.4. 棄上清，加入適量完培養基，重懸細胞，按照比例進行傳代或計數后按照1.1-1.45×104 個/cm2密度進行接種。均勻鋪在培養皿/瓶中，置于37℃，5%CO2 條件下培養。相關數據請見表3。

注意：細胞規模生產建議1:5-1:8 傳代，一般72 小時可以達到90%以上匯合度。

表3.不同體系建議細胞接種數量及加液量

3. 人臍帶間充質干細胞凍存

3.1. 同步驟2.1；

3.2. 同步驟2.2；

3.3. 同步驟2.3；

3.4. 棄上清，用4℃保存的無血清細胞凍存液（治療級）（AC-1001006）重懸細胞，取部分細胞計數。

注意：無血清細胞凍存液即拿即用，用完之后盡快放回4℃冰箱，以防室溫放置太久，影響質量。

3.5. 計數后用無血清細胞凍存液（治療級）（AC-1001006）調節細胞密度至建議凍存密度1-5×106個/mL，每支凍存管（需提前做好標記）分裝1.5-2mL，直接放入-80℃冰箱快速凍存。

3.6. -80℃放置過夜后轉移至液氮長期保存。

4. 間充質干細胞復蘇

4.1. 從液氮中取出凍存的hUMSC，37℃水浴快速融解。

4.2. 在生物安全柜或超凈臺中，先在15mL 離心管中加入5 mL 37℃預熱的完培養基，將解凍后的細

胞懸液緩慢滴加到離心管中。

4.3. 300×g 離心3min，吸掉上清，加入適量完培養基重懸細胞至建議接種濃度（參考表3）。

4.4. 將細胞懸液均勻滴加到培養瓶/皿中，水平十字振動培養瓶/皿使細胞均勻。置于37℃，5% CO2 條

件下培養24 小時后觀察細胞復蘇狀態。

4.5. 細胞無異常即可同時更換新鮮的完培養基繼續培養。

4.6. 初次換液后每48-72 h更換培養液直至傳代。

注意事項

1.     本產品僅限于科學實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領域。

本產品僅限于科學實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領域。