目錄:和元李記（上海）生物技術(shù)有限公司>>PCR&q-PCR>>核酸定量測定>> AN54L029PikoGreen dsDNA quantitation reagent
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 1ML |
|---|---|---|---|
| 貨號 | AN54L029 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 化工,生物產(chǎn)業(yè) |
| 主要用途 | 在存在ssDNA、RNA和單體核苷酸的條件下,可以選擇性地檢測低至25 pg/m |
PikoGreen dsDNA quantitation reagent是一種極為靈敏的雙鏈DNA熒光染料，僅與DNA雙鏈結(jié)合后才發(fā)出熒光，且所產(chǎn)生的熒光與DNA濃度呈正比，在存在ssDNA、RNA和單體核苷酸的條件下，可以選擇性地檢測低至25 pg/mL的dsDNA。與傳統(tǒng)DNA定量方法相比，具有靈敏度高，特異性強，耐受性好，線性范圍寬及方便操作等優(yōu)點，適用于cDNA文庫構(gòu)建、DNA亞克隆、PCR產(chǎn)物等領(lǐng)域的DNA濃度的精確測定。相比傳統(tǒng)的方法，Pikogreen dsDNA Quantitation Reagent定量具有以下優(yōu)勢：
靈敏：數(shù)量級較UV吸光讀數(shù)更敏感，可節(jié)省樣品。
特異性強：只結(jié)合dsDNA，特異性強，不受樣品常規(guī)污染影響。傳統(tǒng)紫外吸光法容易受樣品中存在的單鏈DNA，蛋白，RNA等影響。
耐受性好：耐受較高濃度的鹽、尿素、乙醇、氯仿、去垢劑、蛋白或瓊脂糖，可以直接定量PCR擴增產(chǎn)物而無需從反應(yīng)混合物中純化DNA。
線性范圍寬：PikoGreen dsDNA染料測定DNA濃度，在100pg/ml-100ng/ml范圍內(nèi)呈良好線性；熒光計兼容。
容易使用：在樣品中加入染料，等待5~6 min染色，然后讀數(shù)即可，且適用于96和384孔板。與大多數(shù)基于熒光的酶標儀和可適用于各種DNA樣品分析、PCR的分析、芯片樣品、DNA損傷分析、酶活性分析、基因組DNA定量以及復(fù)雜混合物中dsDNA的檢測和病毒DNA定量等多種領(lǐng)域。
該分析在四個數(shù)量級范圍內(nèi)呈線性，且?guī)缀鯚o序列依賴性，可以精確地測量多個來源的DNA，包括基因組DNA、病毒DNA、小量提取DNA或PCR擴增產(chǎn)物。該方法因其穩(wěn)定性、靈敏性，已經(jīng)錄入《中國藥典》。
訂購信息
| 產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 |
| PikoGreen dsDNA quantitation reagent(優(yōu)于PicoGreen) | AN54L029 | 1 mL |
運輸與保存
藍冰運輸。-20℃避光保存，有效期24個月。
使用方法
1. PikoGreen工作液的配制
使用前將PikoGreen dsDNA定量試劑回溫至室溫；PikoGreen以100 µL 200×的濃縮液形式保存于無水DMSO中的（共10管）。實驗當(dāng)天，根據(jù)實驗需求用1×TE按1:200 的比例稀釋適量定量試劑濃縮液。例如要準備足夠的操作溶液以2 mL檢測體系測定20個樣品，可向19.9 mL 1×TE 中加入100 µL PikoGreen dsDNA 定量試劑。工作液見光易降解，盡量在配好后幾小時內(nèi)使用。
2. 配制標準品DNA溶液
（1）用1 X TE溶液溶解dsDNA制備1 μg/mL dsDNA 。根據(jù)在1 cm 光程長度的比色杯中A260 nm時的吸光度確定DNA 濃度；相應(yīng)于1 μg/mLdsDNA 溶液A260=0.02。標準液常用小牛胸腺DNA制備，PikoGreen 試劑測定法在通常污染核酸*劑的幾種復(fù)合物存在的條件下仍能保持線性良好，但是，為了得到有效的對照處理，被用來做標準曲線的dsDNA 溶液要用和實驗樣品相同的方式來處理，并且應(yīng)該包含相同的可能存在的污染物。
（2）制備從0.5 ng/mL 到500ng/mL（見表1）單重復(fù)8 個點的標準曲線。配制一系列的標準DNA 溶液，然后與等體積的PikoGreen 工作液混和，放入1 x 1cm 比色杯中。混合相同體積的1 x TE 和PikoGreen 操作溶液作為空白對照,避光于室溫下放置2~5 min。
表1: 用1 x 1cm 比色杯時DNA 標準濃度配制參考
| 標準DNA 溶液濃度（ng/mL） | 標準DNA 溶液體積（mL） | PikoGreen 工作液體積（mL） | 標準DNA 終濃度(ng/mL) |
| 1000 | 1 | 1 | 500 |
| 200 | 1 | 1 | 100 |
| 50 | 1 | 1 | 25 |
| 20 | 1 | 1 | 10 |
| 5 | 1 | 1 | 2.5 |
| 2 | 1 | 1 | 1 |
| 1 | 1 | 1 | 0.5 |
| 0 | 1 | 1 | 空白 |
（3） 當(dāng)用微量檢測皿適配器時，PikoGreen 測定也可在較低的測定體積（50 μL 到200 μL）內(nèi)完成。產(chǎn)生從1 ng/mL 到100 ng/mL（見表2）的標準曲線，配制一系列的標準DNA 溶液，然后與等體積的PikoGreen 工作液混和，將至少50 μL 溶液轉(zhuǎn)移到微量檢測皿中。確信不要在樣品中引入氣泡，輕輕地彈微量檢測皿的外部經(jīng)常可以驅(qū)散氣泡。避光于室溫下放置2-5 min。
表2：用微量檢測皿DNA 標準濃配制參考
| 標準DNA 溶液濃度（ng/mL） | 標準DNA 溶液體積（mL） | PikoGreen 工作液體積（mL） | 標準DNA 終濃度(ng/mL) |
| 200 | 30 | 30 | 100 |
| 50 | 30 | 30 | 25 |
| 20 | 30 | 30 | 10 |
| 5 | 30 | 30 | 2.5 |
| 2 | 30 | 30 | 1 |
| 0 | 30 | 30 | 空白 |
（4） 孵育后用合適的熒光計測量樣品熒光值。Ex/Em=480 nm/520 nm，為了減少光漂白，應(yīng)保持所有樣品的檢測時間一致。用熒光值最大的樣品校正儀器。
（5）用檢測數(shù)據(jù)與DNA標準溶液濃度做回歸分析，制作標準曲線。
3. 樣品分析
（1）用1 x TE 稀釋待測DNA 樣品至需要的體積（1x1 cm 比色杯需1.0 mL，微量檢測皿需25~100 μL）。對樣品高度稀釋可以確保任何污染物都被最大限度地沖淡。然而，也要避免取樣體積太小而無法精確吸取的情況。
（2）在每個樣品中加入等體積PikoGreen 工作液，混合好，將混合物移入合適的比色杯，避光于室溫下放置2~5 min。
（3）檢測、讀取熒光值，換算樣品中dsDNA濃度。可以對樣品進行不同的稀釋處理重復(fù)測定以確保結(jié)果的準確性。
注意事項
本產(chǎn)品僅限于科學(xué)實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。
PikoGreen定量試劑含有DMSO，PikoGreen 是結(jié)合dsDNA，操作時采取適當(dāng)防護，戴手套小心操作。
盡管常見污染物不會影響PikoGreen 檢測dsDNA濃度（見表3），但是當(dāng)樣品中dsDNA濃度太低，RNA, ssDNA濃度超過dsDNA 10倍以上時，RNA, ssDNA等污染還是會對檢測結(jié)果產(chǎn)生較大干擾，在此種情況下，RNA 酶可以消除RNA干擾, RNA 酶A、酶T1 、核酸酶S1 結(jié)合能除去ssDNA干擾，從而保證樣品熒光值是由dsDNA 產(chǎn)生。
表3：Pikogreen定量耐受的污染物列表
| 物質(zhì)名稱 | 最大耐受濃度 | 信號變化百分比 |
| Salts | ||
| Ammonium acetate | 50 mM | 3% decrease |
| Sodium acetate | 30 mM | 3% increase |
| Sodium chloride | 200 mM | 30% decrease |
| Zinc chloride | 5 mM | 8% decrease |
| Magnesium chloride | 50 mM | 33% decrease |
| Urea | 2 M | 9% increase |
| Organic Solvents | ||
| Phenol | 0.1% | 13% increase |
| Ethanol | 10% | 12% increase |
| Chloroform | 2% | 14% increase |
| Detergents | ||
| Sodium dodecyl sulfate | 0.01% | 1% decrease |
| Triton X-100 | 0.1% | 7% increase |
| Proteins | ||
| Bovine serum albumin | 2% | 16% decrease |
| IgG | 0.1% | 19% increase |
| Other Compounds | ||
| Polyethylene glycol | 2% | 8% increase |
| Agarose | 0.1% | 4% increase |
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