產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | 保存 | 價格(元) |
EZ ECL Pico化學發(fā)光液(皮克級) | D3030L1262 | 100 mL | 4℃ | 500
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產(chǎn)品描述
《EZ ECL Pico化學發(fā)光液》是一款增強型化學發(fā)光(ECL)HRP底物，可幫助用戶在免疫印跡分析過程中實現(xiàn)低皮克級的蛋白檢測(<10-12g)，極其節(jié)省抗體。本產(chǎn)品一抗?jié)舛确秶?/span>0.2-0.1μg/ml（以1 µg/mL儲存液稀釋1:1,000至1:5,000倍）；二抗?jié)舛?0-50ng/ml（以1 mg/mL儲存液稀釋1:20,000至1:100,000倍）。
EZ Pico底物，為使用辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)物的免疫印跡實驗提供了明亮的信號、低至皮克級檢測靈敏度。該ECL底物能夠兼容各種膜、封閉液和寬范圍抗體稀釋液，以出色性能、通用性和高性價比，滿足用戶的免疫印跡應(yīng)用需求。
EZ Pico底物的特點：
• ECL — 用于辣根過氧化物酶(HRP)的增強型化學發(fā)光底物
• 低至皮克級靈敏度 — 檢測硝化纖維素膜或PVDF膜上皮克級的蛋白條帶
• 長信號持續(xù)時間 — 在條件優(yōu)化情況下，經(jīng)底物孵育的印跡條帶能夠持續(xù)輸出6至8小時的可檢測光信號
• 穩(wěn)定試劑 — 工作液在24小時內(nèi)保持穩(wěn)定；試劑盒在室溫下可穩(wěn)定放置長達1年
• 價格經(jīng)濟 — 針對稀釋的抗體濃度條件進行了優(yōu)化：
本產(chǎn)品優(yōu)于SuperSignal™ West Pico Chemiluminescent Substrate，West Pico為Thermo Fisher公司產(chǎn)品（CAT:34077-34080）
運輸與保存方法
室溫運輸，4℃避光保存，質(zhì)保期大于12個月。
產(chǎn)品組分
組分名稱 | 產(chǎn)品貨號規(guī)格及組分 | |
D3030L1262（100ml） | D3030L1263（500ml） | |
A液 | 50ml | 250ml |
B液 | 50ml | 250ml |
使用方法
1. 按常規(guī)方法執(zhí)行常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、HRP標記抗體或者HRP標記核酸探針孵育、洗膜。
注：優(yōu)化抗原和抗體的濃度。必須使用建議的抗體稀釋度，以保證陽性結(jié)果。將一抗?jié)舛认♂尩?.2～1ug/ml，將二抗?jié)舛认♂尩?0～50ng/mL（*稀釋度取決于一抗和膜上的抗原量）。
2. 新鮮配制發(fā)光工作液：根據(jù)用量將兩種組份按1:1比例混合均勻，備用。
注: 1) 短時間暴露于日光燈下不會損害該工作液，但為獲得*結(jié)果，將此工作液保存在棕色瓶中，避免暴露于任何強光。
2) 取A液和B液一定要用不同的槍頭，工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，室溫放置數(shù)小時后仍可使用但靈敏度略有降低。
3. 用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液，勿使膜*干燥。用移液器將工作液加到膜上（推薦100μl發(fā)光液/cm2膜），使之充分接觸。室溫孵育5分鐘，準備立即壓片曝光。
4. 用平頭鑷子夾起膜，膜的下緣輕輕接觸吸水紙，去除膜上多余的液體，留下少量工作液，不可讓膜*干燥。
5. 在X光膠片暗盒內(nèi)表面鋪一張面積大于膜的保鮮膜。將印跡膜貼在保鮮膜上，將保鮮膜折起來*包裹印跡膜，去除氣泡和皺褶，可剪去邊緣部多余的保鮮膜。用濾紙吸去多余的發(fā)光工作液。用膠帶將覆蓋印跡膜的保鮮膜固定在暗盒內(nèi)，蛋白條帶面向上。
6. 將X光膠片置于膜的上面。建議*次曝光60秒。之后可調(diào)整曝光時間以達到*結(jié)果。化學發(fā)光反應(yīng)在底物孵育后的前5-30分鐘期間是zui強烈的。這一反應(yīng)可以持續(xù)幾個小時，但強度會隨時間下降，如底物孵育較長時間后曝光，曝光時間可能需要延長以獲得較強信號。如果使用磷光存儲成像設(shè)備（如Bio-Rad的分子成像儀系統(tǒng)）或CCD照相機可能需要較長的曝光時間。
注意：膠片與膜之間的任何相對移動，可能在膠片上造成人為的非特異信號。
7. 使用合適的顯影劑和定影劑對膠片進行顯影。如果信號太強，則縮短曝光時間或?qū)⒂∮浤みM行剝離并降低抗體濃度重新檢測。
常見問題及解決方案
問題 | 可能問題 | 解決方案 |
膠片反轉(zhuǎn)像（即黑色背景，白色帶） | 系統(tǒng)中HRP過多 | 將HRP標記二抗稀釋至少10倍 |
膜上有褐色或黃色帶 | ||
印記在暗室中發(fā)光 | ||
信號持續(xù)時間少于8小時 | ||
信號弱或無信號 | 系統(tǒng)中過多的HRP耗盡了底物并導致信號迅速衰減 | 將HRP標記二抗稀釋至少10倍 |
抗原或抗體的量不足 | 增加抗體或抗原的量 | |
蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移率低 | 優(yōu)化轉(zhuǎn)印 | |
HRP或底物活性低 | 見下文注釋 | |
高背景 | 系統(tǒng)中HRP過多 | 將HRP標記二抗稀釋至少10倍 |
封閉不充分 | 優(yōu)化封閉條件 | |
封閉式機不合適 | 嘗試一種不同的封閉試劑 | |
洗滌不充分 | 增加洗滌時間、次數(shù)或洗滌緩沖液體積 | |
膠片過度曝光 | 縮短曝光時間或使用背景消除劑 | |
抗原或抗體的濃度太高 | 減少抗體或抗原的量 | |
蛋白質(zhì)條內(nèi)有斑點 | 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜效率低 | 優(yōu)化轉(zhuǎn)印流程 |
膜的水化不均勻 | 按照制造商建議適度的使膜水化 | |
膠片與膜之間存在氣泡 | 在膠片曝光前，去除氣泡 | |
膠片上背景有斑點 | HRP標記二抗中存在聚集物 | 使用0.2um的過濾器 |
非特異性條帶 | 系統(tǒng)中HRP過多 | 將HRP標記二抗稀釋至少10倍。 |
SDS導致的蛋白非特異性結(jié)合 | 在檢測過程中不使用SDS |
檢測系統(tǒng)有效性（如需要）：在暗室中，在一個清潔試管中加入將1-2ml底物工作液。關(guān)閉燈，添加1ul未稀釋的HRP標記二抗工作液。該溶液應(yīng)當立即發(fā)出藍色光，藍光信號在隨后的幾分鐘漸淡。
注意事項
（1）步驟1～5可在日光燈下操作；但發(fā)光液曝露于強光下時間過久靈敏度可能略有降低，移到暗房操作可避免之。戴手套可以避免在膜上留下手印。
（2）長時間曝光或蛋白過量，將加深背景并使條帶強弱變化失去線性關(guān)系。曝光不足則條帶模糊。
（3）發(fā)光工作液孵育約3分鐘后膜上的條帶發(fā)光。強條帶發(fā)光在暗房中肉眼可見，低豐度蛋白條帶發(fā)光較弱甚至肉眼不可見但可使X光膠片曝光。不能簡單以肉眼觀察判斷條帶發(fā)光時間。肉眼不可見的熒光實際上可持續(xù)數(shù)小時并使X光膠片感光，因而弱帶可曝光1-10小時。如果曝光后條帶不佳，可用洗膜緩沖液洗膜，重新孵育二抗，然后重新用ECL發(fā)光和曝光。
（4）由于超敏發(fā)光液極其靈敏，強烈推薦大多數(shù)進口抗體起始濃度為一抗1:1000～1:4000，二抗1:2000～1:5000。抗體濃度過高將造成高背景或沒有條帶，導致失敗。
（5）某些保鮮膜包裹印跡膜時可能會淬滅熒光，應(yīng)選擇高質(zhì)量保鮮膜。
（6）使用肉眼可見的預染色蛋白Marker和熒光-放射自顯影曝光標簽可確定膠片上條帶的位置和大小。
（7）NaN3能抑制HRP活性，回收第二抗體應(yīng)避免使用NaN3，如必需使用勿超過0.01%。
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