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支原體常用培養基為PPLO，很多公司都有出售。但血清（常用馬血清或豬血清）和抗生素(醋酸跎)需要自己添加。
在液體培養基中通常要加入酚紅做指示劑的，當培養基由紅色變為黃色時，即可判定支原體的生長程度。需要注意的是，支原體的分離可能不太容易，需要多盲傳幾代。液體培養基變黃后，在固體培養基上單克隆，以純化分離的支原體。
一、支原體的培養條件
支原體的培養37°C即可。初次分離培養時，在37°C，5-10% CO2條件下效果更好。
二、支原體的鑒定
主要靠菌落染色、生化反應及特異性生長抑制試驗等。
（1）Dienes菌落染色
Dienes染色液：
美藍：2.5g
天青-II：1.5g
麥芽糖：10g
碳酸鈉：0.5g
蒸餾水：100ml
染色時，直接吸染色液覆蓋菌落，1min后，用生理鹽水洗去染色液，低倍鏡下可見支原體菌落呈藍色，而其他菌菌落不著色。
（2）生化反應
根據不同采樣部位及對底物的分解或者作為能源，可以鑒別不同支原體。
解脲支原體分解尿素不分解精氨酸，生成NH3使培養基的ph升高，酚紅指示劑變紅。
人型支原體分解L－精氨酸不分解尿素，生成NH3使PH值升高，酚紅指示劑變紅。
肺炎支原體分解葡萄糖，使pH降低，酚紅指示劑由紅變黃。
（3）在含0.002%美藍的培養基中肺炎支原體能生長且將美藍還原而退色，其他口腔、唾液或發酵支原體均被抑制生長，此法可鑒定肺炎支原體。
三、常用的支原體培養基配方
（1）基礎培養基
Hayflick培養基（PPLO培養基），牛心粉50g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，加14g瓊脂粉為固體培養基。
（2） 肺炎支原體培養基
基礎培養基 70ml
牛血清 （滅活） 20ml
25%的酵母浸液 10ml
50%葡萄糖 1－2ml 0.4
酚紅 0.5ml
制霉素 0.001g
青霉素 10萬IU
pH 7.8
（3）人型支原體培養基
基礎培養基 70ml
馬血清 20ml 25％的酵母浸液 10ml
30% L－精氨酸 0.33ml
0.4%酚紅 0.5ml
制霉素 0.001g
青霉素 10萬IU
pH 6.3
（4）解脲支原體培養基
基礎培養基 70ml
馬血清 20ml
25%的酵母浸液 10ml
30%尿素0.33ml
0.4%酚紅 0.5ml
制霉素 0.001g
青霉素 10萬IU
pH 6.0
注：支原體能在人工培養基上生長，但是營養要求較高，需要提供膽固醇和酵母才能生長。以上配方中，馬（牛）血清提供膽固醇，酵母浸液提供酵母。
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