臍帶除了提取造血干細胞用于細胞治療外，華通氏膠等基質部分還能提取間充質干細胞，因其MSC的密度較高，為組織修復等需要間充質干細胞的臨床治療帶來便利。

一 人臍帶間充質干細胞無血清培養文獻

人臍帶間充質干細胞的貼壁培養方法主要區別是培養基的選擇。

搜索方法

使用題名“臍帶+間充質干細胞+培養”，摘要“無血清”在中國知網搜索。

使用(Umbilical Cord[Title] AND Mesenchymal Stem Cells[Title]) AND serum free[Title/Abstract] 在Pubmed搜索。

文獻及要點（按發表時間） 臍帶間充質干細胞無血清培養

1 無血清培養體系相較于人血小板裂解液培養體系能一定程度上提高間充質干細胞的體外增殖能力。

2 無動物源成份無血清培養基（自制）可支持臍帶間充質干細胞的體外擴增,維持其免疫學表型及分化潛能,提供數量充足的高質量間充質干細胞,滿足臨床治療及生物醫學研究的需要。

3 無血清與含胎牛血清培養基所培養的人臍帶間充質干細胞在細胞形態、增殖活性、表面標記和分化潛能相似;但在無血清培養基成分中無動物源蛋白引入,是更理想的人臍帶間充質干細胞培養基種類。

4 利用無血清培養體系獲得的人臍帶間充質干細胞治療代償性乙型肝炎肝硬化是安全的,部分患者有效,但其長期的安全性和有效性有待進一步研究證實。

5 無血清培養液培養的人臍帶細胞均為MSC（間充質干細胞）,有傳代增殖潛能,傳代可達臨床治療MSC細胞量,并可避免異種蛋白致敏。

6 利用酶消化法和無血清的培養體系能夠快速分離培養出大量hUCMSCs（人臍帶間充質干細胞）,該方法擴增得到的間充質細胞具備穩定的細胞標記物和生長狀態,可用于各種治療的臨床試驗。

7 無血清培養體系可以保持間充質干細胞（來源：臍帶華通氏膠）的特性,為替代含血清培養體系進行臍帶間充質干細胞原代培養提供了可能。

8 臍帶不同組織來源的MSC的生物學特性及免疫調控作用與骨髓來源的MSC無明顯差異,但在支持造血的功能有所不同,隨著對MSC研究的不斷深入,其應用的范圍將更為廣泛。

9 利用無血清的人間充質干細胞培養基培養體系,臍帶組織培養法能夠分離培養出大量的臍帶間充質干細胞,避免了培養中異種蛋白的混入而降低臨床排異反應。

英文版（按發表時間）

10 無血清培養基中，胰島素促進臍帶基質間充質干細胞的擴增和生長。

11 臍帶華通氏膠間充質干細胞3D分化無血清培養條件：生長因子、細胞因子和小分子。

12 使用無血清培養基培養原代人臍帶間充質干細胞。

13 使用MesenCult-XF 培養基培養人臍帶間充質干細胞。

14 MesenCult-XF無血清培養基培養人臍帶間充質干細胞25代的情況。

15 使用無動物源、無血清培養基培養人臍帶間充質干細胞，不影響MSC的表型和分化潛能。

結論

采用無血清培養基可以進行人臍帶間充質干細胞的原代及傳代培養，同時保有MSC的表型和分化潛力。

二 商用人間充質干細胞無血清培養基

 人間充質干細胞培養基的發展

 *代 培養基+牛血清

 第二代 培養基+牛血清替代品：人血清、血小板裂解液   和臍帶血清

 第三代 無血清、無動物源、成分確定的培養基

第三代人間充質干細胞培養基不含牛血清或人血清之類的血清替代品，無動物源而且成分確定，免除了異種血清帶來的病原體污染風險，而且批次穩定，適合干細胞治療的臨床研究。

品牌      貨號         產品描述

HY StemCell  HX0201M       CCGmHuMTM  Human MSCs Medium 人間充質干細胞無血清培養基，成分確定、無動物源

StemCell    05420       MesenCultTM-XF Medium，Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells 人間充質干細胞培養基，成分確定、無動物源

StemRD     MGro-500     MSC medium,chemically-defined, xeno-free人間充質干細胞無血清培養基，成分確定、無動物源

LONZA      12-725F    UltraCULTURETM Serum-free Medium無血清培養基

文獻目錄及中文摘要

[1]孫亞如,張炳強,王福斌,許評,王二樸,李翠翠.培養體系對維持人臍帶間充質干細胞特性及其體外擴增效率的影響[J].中國組織工程研究,2017,21(13):2023-2028.

摘要：背景:前期數據顯示,應用人血小板裂解液培養體系對人臍帶間充質干細胞進行體外培養時,較無血清培養體系能更好地維持干細胞特性,而無血清培養體系相較于人血小板裂解液培養體系能一定程度上提高間充質干細胞的體外增殖能力。目的:篩選能zui大限度維持人臍帶間充質干細胞特性及擴增效率高的培養體系。方法:將6份人臍帶標本分別接種于6種培養體系中,進行臍帶間充質干細胞原代培養,6種培養體系分別為MesenC ult無血清*培養基中添加2%人血小板裂解液(A組)、StemPro無血清*培養基中添加2%人血小板裂解液(B組)、MesenC ult無血清*培養基(C組)、Stem Pro無血清*培養基(D組)、低糖DMEM中添加體積分數10%胎牛血清(E組)、低糖DMEM中添加10%人血小板裂解液(F組),14 d后進行消化傳代培養,比較各培養體系對人臍帶間充質干細胞形態、表面標記物、分化及增殖能力的影響。結果與結論:(1)D組第3代細胞細長,大小不均;E、F組第3代細胞扁平,其余組第3代細胞為長梭形且大小較均一。A、B組第5代細胞形態及大小較第3代時無明顯變化,C組第5代細胞趨于扁平且大小不均一,D組第5代細胞形態較第3代時細長,E組第5代細胞形態較第3代時扁平,F組第5代細胞形態較第3代時無明顯變化;(2)各組細胞表面標志物檢測結果無明顯區別;(3)A、B組成脂、成骨誘導率較高,E、F組次之,C、D組zui低;(4)A組各代次細胞擴增數量顯著高于C組,B組各代次細胞擴增數量顯著高于D組,E、F組擴增數量顯著低于培養組A、B組;(5)結果表明,無血清和人血小板裂解液相結合的培養基能較好地維持間充質干細胞的特性及擴增效率

[2]任春紅,張昕.無動物源成分培養基用于人臍帶間充質干細胞培養的研究[J].延安大學學報(醫學科學版),2015,13(01):1-4.

摘要：目的建立一種無動物源成份無血清的間充質干細胞培養基XF/SF-MSCM,并探討其支持人臍帶間充質干細胞(h UC-MSCs)體外增殖、維持分化潛能的效果。方法組織塊貼壁法分離獲得原代人臍帶間充質干細胞,P1代起分別使用自制的XF/SF-MSCM培養基與含10%胎牛血清的傳統培養基(SC-MSCM)對臍帶間充質干細胞進行連續培養傳代至P6代,觀察比較兩組P6代細胞的形態及增殖能力,以流式細胞術檢測連續傳代后細胞的免疫學表型,比較其成骨、成脂肪的分化潛能。結果分離獲得的原代P0臍帶間充質干細胞,分別在XF/SFMSCM與SC-MSCM兩種培養基中連續培養傳代,細胞增殖能力及形態無顯著差別。兩組P6代細胞的生長曲線相似,但XF/SF-MSCM組間充質干細胞貼壁的緊密程度稍低;流式細胞檢測結果顯示,XF/SF-MSCM組細胞保持了間充質干細胞的免疫學表型,高表達CD29、CD44、CD90,不表達CD31、CD34、CD45并維持了良好的成骨和脂肪細胞的分化能力。結論本室制備的無動物源成份無血清培養基XF/SF-MSCM可支持臍帶間充質干細胞的體外擴增,維持其免疫學表型及分化潛能,提供數量充足的高質量間充質干細胞,滿足臨床治療及生物醫學研究的需要。

[3]陳林,張坤,董偉,楊珂,艾輝,陳祿華.臍帶間充質干細胞無血清和含胎牛血清培養體系比較[J].重慶理工大學學報(自然科學),2014,28(09):57-61+86.

摘要：為了比較在無血清與含胎牛血清培養基中人臍帶間充質干細胞的增殖能力、生物學特性、分化潛能,將臍帶華通氏膠剝出剪碎,分別在無血清與含胎牛血清培養基中培養擴增臍帶間充質干細胞。用MTT法檢測細胞增殖活性,并繪制生長曲線;在倒置顯微鏡下對細胞形態進行觀察;利用流式細胞儀檢測鑒定其表面標記CD73,CD90,CD105,CD14,CD34,CD45,CD79a及HLA-DR的表達;將成骨及成脂誘導液培養1~2周后觀察其細胞形態學變化,用堿性磷酸酶染色鑒定其成骨情況,油紅O染色鑒定其成脂情況。結果表明:無血清與含胎牛血清培養基所培養的人臍帶間充質干細胞在細胞形態、增殖活性、表面標記和分化潛能相似;但在無血清培養基成分中無動物源蛋白引入,是更理想的人臍帶間充質干細胞培養基種類。

[4]鄧福珠,畢曉云,何蓉,黃舒,陳晶礪,陳嘉榆,王恒湘,郭子寬.無血清培養的臍帶間充質干細胞治療乙型肝炎肝硬化的臨床觀察[J].組織工程與重建外科雜志,2014,10(03):141-144+167.

[5]周平,李丹,陳廣華,王易.無血清培養臍帶間充質干細胞的研究[J].中國實驗血液學雜志,2013,21(05):1256-1260.

摘要：本研究觀察無血清培養液培養的人臍帶間充質干細胞(UC-MSC),并比較與含10%胎牛血清培養液培養的人臍帶間充質干細胞的異同。采集正常足月剖宮產胎兒臍帶,用MesenCult-XF無血清培養液或含10%胎牛血清培養液培養。觀察不同培養液培養的間充質干細胞細胞的形態、免疫表型、細胞周期、增殖分化潛能及對混合淋巴細胞反應的抑制作用。結果表明,采用無血清MesenCult-XF培養液培養的MSC平均傳代倍增6.57±0.7倍,含血清培養液培養的MSC平均傳代倍增4,59±0.45倍(P<0.05);兩種培養液培養的MSC均表達CD44、CD90、CD73、CD105抗原,不表達CD31、CD45、HLA-DR及CD34等抗原,表達程度無明顯統計學差異;無血清培養液培養的MSC(65±5.2)%均為G o/G1期細胞,含血清培養液培養的MSC(62±3.1)%為G o/G1期細胞(P>0.05);兩種培養液培養的人臍帶MSC均可向成脂細胞、成骨細胞分化;無血清培養液培養的臍帶MSC按1 000、5 000、10 000、20 000個細胞/孔接種密度與反應細胞和刺激細胞共培養的每分鐘閃爍值(CPM)分別為(6.43±0.47)×104、(4.30±0.38)×104、(1.97±0.13)×104和(0.24±0.03)×104,含血清培養液培養的MSC與不同密度的混合淋巴細胞共培養的CPM值分別為(7.85±0.07)×104、(5.64±0.12)×104、(3.09±0.18)×104和(1.73±0.05)×104。結論:無血清培養液培養的細胞均為MSC,有傳代增殖潛能,傳代可達臨床治療MSC細胞量,并可避免異種蛋白致敏。

[6]李蘭蘭,馬炬明,陳玲肖.臍帶間充質干細胞無血清培養的實驗研究[J].中國現代醫生,2013,51(27):85-87.

摘要：目的建立一種簡單的體外無血清培養擴增人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)的方法。方法利用酶消化法分離hUCMSCs,在無血清干細胞培養體系下培養擴增,進行形態學觀察,CCK-8法分析細胞生長曲線,流式細胞儀分析細胞表面抗原表達及細胞周期,進行成骨、成脂誘導分化。結果 hUCMSCs呈典型的成纖維細胞形態,具有較強的增殖能力。CD29、CD44、CD90、CD105均呈陽性表達,而CD34、CD45呈陰性表達。3周可誘導分化為脂肪細胞和成骨細胞。結論利用酶消化法和無血清的培養體系能夠快速分離培養出大量hUCMSCs,該方法擴增得到的間充質細胞具備穩定的細胞標記物和生長狀態,可用于各種治療的臨床試驗。

[7]周婷婷,衛超,陳曉東,李海,汪錚.無血清培養體系原代培養臍帶間充質干細胞[J].中國組織工程研究,2013,17(27):4980-4987.

摘要：背景: 以含血清培養基培養的臍帶間充質干細胞,存在著進一步應用的障礙。目的: 建立無血清培養體系原代培養臍帶間充質干細胞。方法: 取臍帶華通氏膠(Wharton’sJelly),采用機械法將組織膠切碎,1-3mm3大小,分別培養到含胎牛血清*培養液中以及無血清培養液中。培養第11,14,17天收獲細胞并進行相關檢測。在符合2006年制定的干細胞zui低評估標準的基礎上,以集落形成單元指標評估何種培養體系能獲得較多高質量的原代細胞。結果與結論: 無血清培養體系相對于經典的含血清的培養體系而言,細胞生長速度更快。另外,培養第11天,集落形成實驗表明無血清培養體系下能獲得更多的集落。因此,無血清培養體系可以保持間充質干細胞的特性,為替代含血清培養體系進行臍帶間充質干細胞原代培養提供了可能。

[8]徐曼. 人臍帶不同組織來源間充質干細胞的分離培養及其免疫調控能力和支持造血的實驗研究[D].2011.

摘要：間充質干細胞(mesenchymal stem cell,MSC)是來源于發育早期中胚層的具有高度自我更新和多向分化潛能的多能干細胞,廣泛存在于全身多種組織中。大量研究證明,MSC具有低免疫原性、多向分化潛能、調節免疫以及分離培養操作簡便等特點。MSC的臨床研究已經在許多國家開展,作為種子細胞,臨床上主要用于治療機體無法自然修復的組織細胞和器官損傷等多種難治性疾病,如脊髓損傷、腦癱、肌萎縮側索硬化癥、中風、糖尿病、糖尿病足、肝硬化等;作為免疫調節和造血支持細胞,用于治療免疫排斥和自身免疫性疾病,如系統性紅斑狼瘡、系統性硬化癥、克隆氏病等。MSCzui早在骨髓中發現,但骨髓中含量極少,且骨髓源性MSC存在高度病毒污染的可能,并且隨著年齡的增長其細胞數量和擴增分化能力亦顯著降低。近年來,國內外大量研究證明臍帶作為胎兒發育的一部分,含有大量的多能干細胞,細胞生長擴增速度快,且臍帶屬于胚胎外組織,在胎兒娩出后成為“廢棄物”,取材方便,來源豐富,無倫理學問題,因此,被看作是骨髓間充質干細胞的主要替代品,具有巨大的臨床應用價值。不同學者分別從整條臍帶、臍帶的基質、臍靜脈內皮中分離獲得MSC,還有為數不少的學者從胎盤羊膜中分離獲得MSC。考慮到臍帶組織構成簡單,包括表皮(羊膜上皮細胞)、基質(Wharton’s jelly)及血管,既無毛細血管也無淋巴管,但其超微結構、免疫組化和活體功能研究顯示,羊膜下、血管間和血管周圍區域在細胞數量和特性上均有顯著差異,為此,我們擬將這三種組織分開,從中分別分離、培養、擴增MSC,并研究其生物學特性、免疫調控能力及造血支持作用,為臨床應用提供重要依據。首先,我們通過機械分離及膠原酶消化法分別從人臍帶的羊膜(Amnion)、基質(Wharton’s jelly)及血管(Vessel)中獲得組織細胞,通過反復貼壁純化獲得AM-MSC、WJ-MSC、VS-MSC;從整條臍帶(Umbilical cord)中獲得UC-MSC;通過密度梯度離心法從骨髓(Bone marrow)中分離得到單個核細胞,同樣通過反復貼壁純化獲得BM-MSC。然后,從細胞形態、細胞生長曲線、細胞周期、多向分化潛能特性及細胞免疫表型五個方面進行比較和鑒定。結果表明,五組MSC具有相似的生物學特征:1)細胞培養至第3代細胞形態相對均一,為典型的成纖維樣,呈平行或漩渦狀排列;2)細胞具有強大的體外擴增能力;3)均有80%以上的細胞處于G0/G1,提示臍帶不同來源的MSC同BM-MSC一樣均具有典型的干細胞增殖特點,即只有少數細胞處于活躍的增殖期;但BM-MSC的培養需添加低濃度的細胞生長因子bFGF,且培養至5代后擴增能力逐漸減低,而臍帶來源的MSC僅在低營養條件下即能大量擴增,傳代至第14代,細胞生物學特性無明顯改變;4)對其誘導多向分化,結果表明,細胞可向成骨、成脂肪和成軟骨方向分化,但與BM-MSC相比臍帶來源的MSC成骨能力略低,臍帶來源的MSC各組間無差異;5)流式細胞儀檢測細胞免疫表型,結果表明,臍帶不同組織來源的MSC同BM-MSC類似,均表達間充質干細胞特異性抗原CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106、CD166、HLA-ABC及多能干細胞標志物TRA-1-60,低表達或不表達造血及內皮細胞表面標志即CD14、CD31、CD34、CD45,以及移植免疫排斥相關的表面標志HLA-DR、CD80、CD86、CD40、CD40L;各組細胞表型進行比較,CD166表達有顯著差異,CD31、CD106、HLA-DR的表達具有高度的顯著差異。其次,通過淋巴母細胞轉化實驗及混合淋巴細胞反應檢測其免疫調控能力。結果表明,對于有絲分裂原及異體抗原誘導的T淋巴細胞的增殖各組MSC均有抑制作用,且這種抑制作用具有劑量依賴性,隨MSC的細胞數量逐漸增加,其抑制效應逐漸增強;實時定量PCR和RT-PCR方法檢測與免疫相關的細胞因子IL-10、IL-11和TGF-β1的表達亦無顯著差別,但UC-MSC組分泌的IL-6與WJ-MSC、VS-MSC、AM-MSC、BM-MSC組相比差異極其顯著(P=0.0000),WJ-MSC與AM-MSC相比也有明顯差別(p=0.008)。zui后,探討臍帶不同組織來源的MSC的造血支持作用。以臍帶不同組織來源的MSC為飼養層,與臍帶血造血干/祖細胞在無血清培養體系下共培養7天,檢測有核細胞、CD34+細胞和造血集落的擴增效率。結果顯示,MSC可以在體外有效支持造血干/祖細胞的擴增,與對照組相比差異高度顯著;且UC-MSC組的有核細胞、CD34+細胞及CFU-C的擴增效率均顯著高于WJ-MSC、VS-MSC和AM-MSC組,多能干細胞集落CFU-Mix的擴增效率未見顯著差異;后三者之間進行比較,WJ-MSC組和VS-MSC組對紅系祖細胞及粒、單核系祖細胞的擴增效率高于AM-MSC組,且經實時定量PCR和RT-PCR方法檢測MSC分泌的造血生長因子的mRNA相對表達量,其差異也支持了這一結論,其中IL-3、IL-11、HGF、TPO、EPO、VEGF、M-CSF和G-CSF的表達水平無顯著差異,而UC-MSC組IL-6、SCF、FLT3、LIF的表達量顯著高于其它各組。上述結果提示,臍帶不同組織來源的MSC的生物學特性及免疫調控作用與骨髓來源的MSC無明顯差異,但在支持造血的功能有所不同,隨著對MSC研究的不斷深入,其應用的范圍將更為廣泛。而作為種子細胞,不同組織來源的MSC的功能亦有不同,值得我們進一步深入探討和研究。

[9]方彥艷,馬健.無血清培養基分離培養臍帶間充質干細胞的研究[J].同濟大學學報(醫學版),2010,31(05):21-24.

摘要：目的探討應用無血清培養體系分離培養臍帶間充質干細胞,明確其成骨生物學特性,為臨床應用奠定實驗基礎。方法在無血清干細胞培養體系下,利用組織塊貼壁培養法分離培養,擴增臍帶間充質干細胞,在倒置顯微鏡進行形態學觀察,流式細胞檢測鑒定其表面標記CD34、CD44、CD90及CD45的表達,成骨誘導液培養2～3周后觀察其細胞形態學變化,茜素紅染色鑒定其成骨情況。結果臍帶組織塊接種后第1次更換培養液12h后,有少量梭形的細胞從臍帶組織邊緣爬出,培養5～6d左右成單層狀生長,12d左右梭形狀細胞呈現復層生長趨勢,細胞表面標記CD44、CD90均呈陽性為間充干細胞來源,CD34、CD45均呈陰性為非造血干細胞來源;細胞經成骨誘導2～3周后具有良好的分化成骨能力。結論利用無血清的人間充質干細胞培養基培養體系,臍帶組織培養法能夠分離培養出大量的臍帶間充質干細胞,避免了培養中異種蛋白的混入而降低臨床排異反應。

10.Insulin Promotes the Proliferation of Human Umbilical Cord Matrix-Derived Mesenchymal Stem Cells by Activating the Akt-Cyclin D1 Axis.

Li P, Wei J, Gao X, Wei B, Lin H, Huang R, Niu Y, Lim K, Jing K, Chu J.

Stem Cells Int. 2017;2017:7371615. doi: 10.1155/2017/7371615. Epub 2017 Apr 18.

11.Defined three-dimensional culture conditions mediate efficient induction of definitive endoderm lineage from human umbilical cord Wharton's jelly mesenchymal stem cells.

Al Madhoun A, Ali H, AlKandari S, Atizado VL, Akhter N, Al-Mulla F, Atari M.

Stem Cell Res Ther. 2016 Nov 16;7(1):165.

12.Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance.

Li Y, Guo G, Li L, Chen F, Bao J, Shi YJ, Bu H.

Cell Tissue Res. 2015 May;360(2):297-307. doi: 10.1007/s00441-014-2055-x. Epub 2015 Mar 8.

13.Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells do not undergo malignant transformation during long-term culturing in serum-free medium.

Chen G, Yue A, Ruan Z, Yin Y, Wang R, Ren Y, Zhu L.

PLoS One. 2014 Jun 2;9(6):e98565. doi: 10.1371/journal.pone.0098565. eCollection 2014.

14.Monitoring the biology stability of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells during long-term culture in serum-free medium.

Chen G, Yue A, Ruan Z, Yin Y, Wang R, Ren Y, Zhu L.

Cell Tissue Bank. 2014 Dec;15(4):513-21. doi: 10.1007/s10561-014-9420-6. Epub 2014 Jan 10.

15.Umbilical cord tissue-derived mesenchymal stem cells grow best under GMP-compliant culture conditions and maintain their phenotypic and functional properties.

Hartmann I, Hollweck T, Haffner S, Krebs M, Meiser B, Reichart B, Eissner G.

J Immunol Methods. 2010 Dec 15;363(1):80-9. doi: 10.1016/j.jim.2010.10.008. Epub 2010 Oct 28.