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Rubicon WGA Kit 單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒說明書
閱讀：3388發(fā)布時(shí)間：2017-11-6
A 產(chǎn)品組成—PicoPLEX WGA Kit 單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒
組份 | 蓋子顏色 |
Cell Extraction Buffer 細(xì)胞提取緩沖液 | 綠色 |
Extraction Enzyme Dilution Buffer 提取酶稀釋緩沖液 | 紫色 |
Cell Extraction Enzyme 細(xì)胞提取酶 | 黃色 |
Pre-Amp Buffer 預(yù)擴(kuò)增緩沖液 | 紅色 |
Pre-Amp Enzyme 預(yù)擴(kuò)增酶 | 白色 |
Amplification Buffer 擴(kuò)增緩沖液 | 桔色 |
Amplification Enzyme 擴(kuò)增酶 | 藍(lán)色 |
Nuclease-Free water 無核酸酶水 | 無色 |
User Manual 使用手冊(cè) |
試劑量可供50次反應(yīng)。
B PicoPLEX WGA Kit儲(chǔ)存與處理
-20℃儲(chǔ)存。
使用前，細(xì)胞提取酶、預(yù)擴(kuò)增酶和擴(kuò)增酶組份放到冰上。其他組份使用前在冰上解凍并且稍微漩渦振蕩（vortex and quick-spin）。
試劑儲(chǔ)存、處理和反應(yīng)設(shè)置都要遵守實(shí)驗(yàn)室PCR操作規(guī)范。
C單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒其他準(zhǔn)備材料
熱循環(huán)儀（PCR儀，推薦使用實(shí)時(shí)PCR儀）
PCR管或96孔PCR板
低吸附吸頭（Low-binding barrier tips）
磷酸鹽緩沖液（PBS）
D PicoPLEX WGA Kit 單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒產(chǎn)品描述
單管，3步，PicoPlEX WGA試劑盒專門用于人單細(xì)胞和pg級(jí)DNA的擴(kuò)增，具有可重復(fù)性、低背景的特點(diǎn)。3小時(shí)內(nèi)完成細(xì)胞裂解、熱循環(huán)文庫制備和低背景擴(kuò)增，zui終能得到2-5µg擴(kuò)增DNA。
PicoPLEX單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增流程
細(xì)胞+裂解/提取緩沖液，15min ——預(yù)擴(kuò)增混合液，90min ——擴(kuò)增混合液，30min ——分析
PicoPLEX WGA Kit適用樣本
1.1-10個(gè)人細(xì)胞，如：囊胚細(xì)胞、極體、滋胚層細(xì)胞、羊水細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞等。
2.1000-10000個(gè)細(xì)菌細(xì)胞
3.分離DNA（15pg-50pg人DNA）
4.分選染色體（Sorted Chromosomes ）
5.不完整或片段化，單/雙鏈DNA
6.樣本zui大體積：5µL
E PicoPLEX WGA全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用
拷貝數(shù)變異（CNV）分析，基于oligonucleotide aCGH, BAC aCGH, or qPCR
SNP 基因表型
突變檢測(cè)
F PicoPLEX單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增細(xì)胞樣本采集
細(xì)胞采集方法
兼容PicoPLEX WGA Kit的正確細(xì)胞采集方法有流式分選術(shù)，稀釋和顯微操作。細(xì)胞染色后可能會(huì)對(duì)試劑盒性能造成不好影響。為了得到*結(jié)果，一定要避免使用福爾馬林固定法。
細(xì)胞洗滌
細(xì)胞樣本制備時(shí)強(qiáng)烈推薦用PBS洗滌，以盡量減少非細(xì)胞DNA污染。選擇不含鎂、鈣、BSA的PBS。zui終細(xì)胞樣本中所含PBS體積不能超過2.5µL。
G 使用擴(kuò)增后的對(duì)照DNA作為參照
DNA對(duì)照樣本對(duì)于某些如微陣列和qPCR平臺(tái)有參照價(jià)值。為了得到更準(zhǔn)確的結(jié)果，強(qiáng)烈推薦PicoPLEX擴(kuò)增樣本的對(duì)照選擇PicoPLEX擴(kuò)增后的DNA對(duì)照而不是沒有擴(kuò)增的DNA對(duì)照。
DNA對(duì)照樣本按樣本配制方法（J）配制，按PicoPLEX操作步驟（K）擴(kuò)增。Pooling DNA對(duì)照的擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物可以得到*結(jié)果。
H PicoPLEX WGA全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物純化和定量
WGA單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物用于下游時(shí)，許多應(yīng)用使用前需要純化和定量。純化方法可以使用 spin columns或過濾板。
產(chǎn)物定量使用紫外吸光度法（UV absorbance ，1 OD260 = 50 µg/mL）。PicoGreen™或其他雙鏈DNA定量法所得PicoPLEX產(chǎn)物密度可能不可靠。
純化后的PicoPLEX擴(kuò)增產(chǎn)物-20 °C儲(chǔ)存。
I 選擇合適的反應(yīng)管/反應(yīng)板
PicoPLEX操作指南的步驟7中，如果孵育時(shí)PCR管/板密封性不夠，會(huì)造成大量（>5 µL）的試劑蒸發(fā)，zui終影響PicoPLEX WGA結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性。
步驟7也可以加15 µL 水，無視所選反應(yīng)管/板密封性能否盡量減少蒸發(fā)造成的體積損失。（A mock PicoPLEX Protocol Step 6 incubation using 15 µL of water is advised to confirm whether a selected tube or plate/seal combination can be used with minimal volume loss due to evaporation.）
J樣本配制方法
5µL細(xì)胞樣本
1.依照F所述方法用PBS稀釋或淋洗細(xì)胞。
2.如果采用流式分選采集細(xì)胞：
單個(gè)細(xì)胞加入含5 µL細(xì)胞提取緩沖液（綠蓋）的PCR管/孔。
如果采用顯微操作或稀釋法：
單個(gè)細(xì)胞先用zui少PBS（<2.5 µL)）混合，再加入含適量細(xì)胞提取緩沖液（綠蓋）的PCR管/孔，zui終樣本體積5 µL。
- 配制好的細(xì)胞立即 -80 °C 凍存或直接進(jìn)行擴(kuò)增操作。
5µL DNA樣品（單細(xì)胞simulation）
1.配制1 ng/µL 純化DNA溶液：PCR管/孔中，5 mM Tris-HCl (pH8.0)稀釋對(duì)照DNA。
2.漩渦振蕩30s。
3.配制15 pg/µL DNA溶液：3µL 1 ng/µL DNA溶液+197 µL 5 mM Tris-HCl (pH 8.0)。
4.漩渦振蕩30s。
5.PCR管/孔中，1 µL 15 pg/µL DNA溶液+ 4 µL 細(xì)胞提取緩沖液（綠蓋）。
K PicoPLEX操作步驟
細(xì)胞提取
1.添加提取混合液各組份并充分混勻。
Extraction Cocktail Component 提取混合液組份 | 蓋子顏色 |
Extraction Enzyme Dilution Buffer 提取酶稀釋緩沖液 | 紫色 |
Cell Extraction Enzyme細(xì)胞提取酶 | 黃色 |
2.每5µL細(xì)胞樣本或DNA樣本（J部分配制）加5 µL新鮮配制的提取混合液。
3.按下表在熱循環(huán)儀中孵育樣本：
1 cycle | 75 °C | 10 min |
1 cycle | 95 °C | 4 min |
1 cycle | 室溫 | Hold |
4.試管/板稍微離心。
預(yù)擴(kuò)增
5.添加預(yù)擴(kuò)增混合液各組份并充分混勻。
Pre-Amp Cocktail Component 預(yù)擴(kuò)增混合液各組份 | 蓋子顏色 |
Pre-Amp Buffer 預(yù)擴(kuò)增緩沖液 | 紅色 |
Pre-Amp Enzyme 預(yù)擴(kuò)增酶 | 白色 |
6.每個(gè)細(xì)胞樣本/DNA樣本加5µL預(yù)擴(kuò)增混合液。
7.按下表在熱循環(huán)儀中孵育樣本：
1 cycle | 95°C | 2 min |
12 cycles | 95°C | 15 s |
15°C | 50 s | |
25°C | 40 s | |
35°C | 30 s | |
65°C | 40 s | |
75°C | 40 s | |
1 cycle | 4°C | Hold |
8.稍微離心，預(yù)擴(kuò)增孵育產(chǎn)物放到冰上。
擴(kuò)增
9.添加擴(kuò)增混合液各組份并充分混勻。
Amplification Cocktail Component 擴(kuò)增混合液組份 | 蓋子顏色 |
Amplification Buffer 擴(kuò)增緩沖液 | 桔色 |
Amplification Enzyme 擴(kuò)增酶 | 藍(lán)色 |
Nuclease-Free Water 無核酸酶水 | 透明 |
注意：樣本擴(kuò)增效率可以通過在擴(kuò)增混合液中添加SYBR Green I dye（zui終密度：0.125x）進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR儀分析。一些儀器需要額外添加其他染色劑做信號(hào)歸一化（signal normalization）。
10. 新鮮配制的擴(kuò)增混合液取60 µL和15 µL預(yù)擴(kuò)增孵育產(chǎn)物混合，吸管混勻。
11.按下表在熱循環(huán)儀中擴(kuò)增樣本：
1 cycle | 95 °C | 2 min |
14 cycles | 95°C | 15 s |
65°C | 1 min | |
75°C | 1 min | |
1 cycle | 4°C | hold |
注意：基于Rubicon用流式分選培養(yǎng)細(xì)胞的測(cè)試，推薦14 cycles。一些細(xì)胞類型要獲得zui高產(chǎn)量，可能需要更多cycles（zui高達(dá)16 cycles）。
12.PicoPLEX 擴(kuò)增產(chǎn)物立即 -20 °C儲(chǔ)存或用于下游純化（見H）。
RB3050 Rubicon PicoPLEX WGA Kit 單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒說明書由華雅再生醫(yī)學(xué)旗艦公司：紅榮微再翻譯。
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RB3050 Rubicon PicoPLEX WGA Kit 單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒
從單細(xì)胞中擴(kuò)增DNA構(gòu)建高重復(fù)性的文庫現(xiàn)在成為可能。PicoPLEX WGA kit采用技術(shù)，設(shè)計(jì)、優(yōu)化用于從單細(xì)胞中擴(kuò)增單拷貝基因組DNA。起始量低至單細(xì)胞或6pg基因組DNA。便捷的單管操作流程減少失誤，節(jié)省時(shí)間并降低反應(yīng)背景。
PicoPLEX WGA Kit兼容微陣列比較基因組雜交（array CGH）分析及PCR平臺(tái)，被試管嬰兒行業(yè)供應(yīng)商如BlueGnome信賴并用于PGS/PGD。
產(chǎn)品訂購信息
貨號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
RB3050/R30050 | PicoPLEX WGA Kit單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒，array CGH、PCR分析用 | 50次反應(yīng) |
RB3381/R300381 | PicoPLEX DNA-seq Kit，48種雙端illumina引物 | 48 |
選購RB3050 Rubicon PicoPLEX WGA Kit 單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒產(chǎn)品歡迎您致電 華雅再生醫(yī)學(xué)旗艦公司：紅榮微再（上海）生物工程技術(shù)有限公司 ：152 1681 4001。華雅再生醫(yī)學(xué)-客服: 316 808 6348。
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