操作步驟

熒光定量PCR 實驗步驟:

折疊樣品RNA的抽提

①取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其*溶解。

②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。

③RNA沉淀 將水相上層轉移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊。

④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀。混勻后，4℃下7000rpm離心5分鐘。

⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。

⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復吹打幾次，使其*溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。

折疊RNA質量檢測

1)紫外吸收法測定

先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。

① 濃度測定

A260下讀值為1表示40 μg RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計算公式為:A260 ×稀釋倍數× 40 μg/ml。具體計算如下:

RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀釋495μl的TE中，測得A260 = 0.21

RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl

取5ul用來測量以后，剩余樣品RNA為35 μl，剩余RNA總量為:

35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg

②純度檢測

RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。

2)變性瓊脂糖凝膠電泳測定

①制膠

1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻60℃，10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。

10×MOPS電泳緩沖液

濃度 成分

0.4M MOPS，pH 7.0

0.1M 乙酸鈉

0.01M EDTA

灌制凝膠板，預留加樣孔少可以加入25 μl溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內，加足量的1×MOPS電泳緩沖液覆蓋膠面幾個毫米。

②準備RNA樣品

取3μgRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中終濃度為10μg/ml。加熱70℃孵育15分鐘使樣品變性。

③電泳

上樣前凝膠須預電泳5min，隨后將樣品加入上樣孔。5–6V/cm電壓下2h，電泳溴酚蘭指示劑進膠少2–3cm。

④紫外透射光下觀察并拍照

28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃(其大小決定于用于抽提RNA的物種類型)，上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶，它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖體RNA)組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現DNA污染，將會在28S核糖體RNA帶的上面出現，即更高分子量的彌散遷移物質或者帶，RNA的降解表現為核糖體RNA帶的彌散。用數碼照相機拍下電泳結果。

折疊樣品cDNA合成

①反應體系

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

②混合液在加入逆轉錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鐘，取出后立即冰水浴管內外溫度一致，然后加逆轉錄酶0.5μl，37℃水浴60分鐘。

③取出后立即95℃干浴3分鐘，得到逆轉錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80℃待用。

折疊樣品

管家基因(β-actin)實時定量PCR

①β-actin陽性模板的標準梯度制備 陽性模板的濃度為10，反應前取3μl按10倍稀釋(加水27μl并充分混勻)為10，依次稀釋10、10、10、10、10、10，以備用。

②反應體系如下:

標準品反應體系

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

管家基因反應體系:

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

③制備好的陽性標準品和檢測樣本同時上機，反應條件為:93℃2分鐘，然后93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個循環。

折疊模板

①針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達該基因的cDNA模板進行PCR反應。

反應體系:

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

35個PCR循環(94℃1分鐘;55℃1分鐘;72℃1分鐘); 72℃延伸5分鐘。

②PCR產物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。

③將PCR產物進行10倍梯度稀釋: 設定PCR產物濃度為1×10，依次稀釋10、10、10、10、10、10幾個濃度梯度。

折疊PCR

①所有cDNA樣品分別配置實時定量 PCR反應體系。

體系配置如下:

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

②將配制好的PCR反應溶液置于Realtime PCR儀上進行PCR擴增反應。反應條件為:93℃2分鐘預變性，然后按93℃ 1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共40做個循環，后72℃7分鐘延伸。

折疊引物列表

引物設計軟件:Primer Premier 5.0，并遵循以下原則:引物與模板的序列緊密互補;引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或發夾結構;引物不在模板的非目的位點引發DNA 聚合反應(即錯配)。

折疊電泳

各樣品的目的基因和管家基因分別進行Realtime PCR反應。PCR產物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，GoldView染色，檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。