LipiRADICAL Green（檢測(cè)試劑）/OH-Pen（抑制物質(zhì)）

脂質(zhì)過氧化研究的新工具！脂質(zhì)自由基檢測(cè)試劑和抑制物質(zhì)

LipiRADICAL Green是特異性熒光檢測(cè)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的上游因子脂質(zhì)自由基的試劑。可用于活細(xì)胞成像、樣品中脂質(zhì)自由基含量的相對(duì)定量以及樣品中脂質(zhì)自由基的結(jié)構(gòu)分析和全面鑒定。另外，OH-Pen還可作為脂質(zhì)自由基特異性中和劑使用。

※ 本產(chǎn)品基于九州大學(xué)大學(xué)院藥學(xué)研究院 生命物理化學(xué)領(lǐng)域 山田健一教授的研究結(jié)果商品化并銷售。

※ 本產(chǎn)品僅供研究用，研究以外不可使用。

本試劑的概要圖和活細(xì)胞成像示例

脂質(zhì)自由基發(fā)生特異性反應(yīng)產(chǎn)生綠色熒光的LipiRADICAL Green原理示意圖（左），以及Hepa1-6細(xì)胞被藥物刺激時(shí)的活細(xì)胞成像示例（右）。

◆什么是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)（LPO）和脂質(zhì)自由基（Lipid radical）？

脂質(zhì)過氧化反應(yīng)（lipid peroxidation; LPO）是指由于氧化應(yīng)激脂質(zhì)被氧化分解的反應(yīng)，是脂質(zhì)分解的過程之一。以含有多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acid; PUFA）的脂質(zhì)為起點(diǎn)，目前已提出兩種脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的發(fā)生過程：

1.氧化應(yīng)激引起的脂質(zhì)自由基產(chǎn)生

2. Lipoxygenase引起的過氧化脂質(zhì)生成和鐵離子依賴性過氧化脂質(zhì)自由基的產(chǎn)生

第1種發(fā)生過程是由含PUFA的脂質(zhì)暴露于氧化應(yīng)激（活性氧ROS）時(shí)產(chǎn)生脂質(zhì)自由基（L.；Lipid radical）開始。脂質(zhì)自由基容易被氧化并轉(zhuǎn)化為過氧化脂質(zhì)自由基（LOO?; Lipid peroxyl radical），誘導(dǎo)自由基連鎖反應(yīng)。在第2種發(fā)生過程中，含PUFA的脂質(zhì)被過氧化催化酶lipoxygenase轉(zhuǎn)化為過氧化脂質(zhì)（LOOH），并在存在大量的鐵離子Fe²⁺ 時(shí)會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生過氧化脂質(zhì)自由基（LOO?）。過氧化脂質(zhì)自由基與其他脂質(zhì)反應(yīng)，誘導(dǎo)自由基連鎖反應(yīng)。

兩種過程所產(chǎn)生的過氧化脂質(zhì)自由基（LOO?）都會(huì)在與其他脂質(zhì)發(fā)生自由基反應(yīng)并擴(kuò)大自由基連鎖反應(yīng)，同時(shí)產(chǎn)生各種過氧化脂質(zhì)（LOOH）。該自由基連鎖反應(yīng)直至被抗氧化劑聚合前會(huì)持續(xù)進(jìn)行，并生成各種脂質(zhì)結(jié)構(gòu)或醛，終產(chǎn)生復(fù)數(shù)的反應(yīng)活性醛，如acrolein、malondialdehyde（MDA）、4-hydroxy-2-nonenal （4-HNE）等。以這些下游活性物質(zhì)為起因，會(huì)對(duì)ER應(yīng)激、細(xì)胞毒性和誘導(dǎo)鐵死亡等產(chǎn)生各種影響。

脂質(zhì)自由基（以及過氧化脂質(zhì)自由基）被認(rèn)為是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)中重要的上游因子，雖然其檢測(cè)方法備受期待，但直到現(xiàn)在，也僅有電子自旋共振（ESR）法等需要特殊設(shè)備的方法。LipiRADICAL Green和OH-Pen是由九州大學(xué)大學(xué)院藥學(xué)院研究院生命物理化學(xué)系的山田健一教授等人開發(fā)的、具有新型氮氧化物骨架的脂質(zhì)自由基響應(yīng)性熒光試劑（原著名稱為NBD-Pen）和抑制劑，它們不與活性氧自由基反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)特異性響應(yīng)脂質(zhì)自由基。由于LipiRADICAL Green可通過熒光檢測(cè)來(lái)觀察/分析脂質(zhì)自由基，因此可用作以脂質(zhì)自由基為中心的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的新工具。OH-Pen是從LipiRADICAL中去除熒光基團(tuán)NBD的化合物，與一般的自由基中和劑（TEMPO等）不同，對(duì)脂質(zhì)自由基顯示高選擇性，可作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的特異性抑制劑使用。

◆原理

LipiRADICAL Green是向穩(wěn)定自由基化合物的氮氧化物衍生物中添加熒光色素NBD的化合物。由于氮氧化物對(duì)脂質(zhì)自由基顯示高特異性，所以導(dǎo)入了戊基。LipiRADICAL Green此時(shí)處于消光狀態(tài)，但通過脂質(zhì)自由基與自由基-自由基偶聯(lián)形成共價(jià)鍵后，顯示綠色熒光。通過觀察該綠色熒光強(qiáng)度，可相對(duì)定量樣品中脂質(zhì)自由基含量。

OH-Pen是LipiRADICAL Green的NBD轉(zhuǎn)化為羥基的化合物，顯示相同的脂質(zhì)自由基選擇性以及擁有相同的脂質(zhì)自由基中和作用。因此可將其用作脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的抑制劑。

概述：對(duì)使用LipiRADICAL Green的脂質(zhì)自由基進(jìn)行全面分析

通過使用LipiRADICAL Green的熒光檢測(cè)LC/MS-MS法可全面分析脂質(zhì)自由基和過氧化脂質(zhì)自由基。原著論文5中，已成功地從5種類型的PUFA中鑒定出共計(jì)132種脂質(zhì)自由基。以下為流程概述，詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案、LC/MS-MS設(shè)置方法/分析方法，請(qǐng)參閱原著論文5。

■概述

◆特點(diǎn)

LipiRADICAL Green

●　本試劑為消光狀態(tài)，與脂質(zhì)自由基/過氧化脂質(zhì)自由基特異性反應(yīng)，發(fā)出綠色熒光。

●　檢測(cè)波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)：激發(fā)470 nm /熒光520-600 nm（大~540 nm）。 

※ 詳情請(qǐng)參閱數(shù)據(jù)。

●　對(duì)脂質(zhì)自由基和過氧化脂質(zhì)自由基具有特異性，在活性氧（H₂O₂、ClO^-?、O₂^-?、?OH）中不發(fā)出熒光。

●　可通過熒光強(qiáng)度相對(duì)定量體外樣品中的脂質(zhì)自由基含量。

●　施藥于動(dòng)物個(gè)體后，可在組織水平上進(jìn)行染色以及相對(duì)定量活體內(nèi)的自由基含量。

※ 由于脂質(zhì)自由基非常不穩(wěn)定且會(huì)迅速分解，需要對(duì)實(shí)驗(yàn)方法和條件設(shè)置進(jìn)行驗(yàn)證。詳情請(qǐng)參閱原著論文1。

●　可用于評(píng)價(jià)任意化合物的脂質(zhì)自由基誘導(dǎo)活性和抗氧化活性。

※ 詳情請(qǐng)參閱原著論文4。

●　通過用熒光檢測(cè)LC/MS可全面結(jié)構(gòu)分析脂質(zhì)自由基和過氧化脂質(zhì)自由基。

※ 脂質(zhì)自由基和過氧化脂質(zhì)自由基的結(jié)構(gòu)分析方法，請(qǐng)參考原著論文5。

OH-Pen

●　與脂質(zhì)自由基和過氧化脂質(zhì)自由基發(fā)生特異性反應(yīng)以抑制自由基連鎖反應(yīng)，可用作脂質(zhì)過氧化反應(yīng)信號(hào)上游的抑

      制劑。

●　雖然是自由基化合物，但非常穩(wěn)定，可體外施藥至動(dòng)物個(gè)體。

●　肝細(xì)胞癌的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停╠iethylnitrosamine（DEN）給藥模型）中顯示，可抑制DEN誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化反

      應(yīng)信號(hào)和組織損傷標(biāo)志物。

注意：LipiRADICAL Green和OH-Pen的區(qū)別在于有無(wú)熒光基團(tuán)（請(qǐng)參閱“原理”），對(duì)脂質(zhì)自由基的反應(yīng)性相

          同，同時(shí)使用時(shí)，可能會(huì)引起對(duì)脂質(zhì)自由基的競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)，因此需注意使用方法。

◆原著論文

1)　Yamada Nat. Chem.Biol.,12,608～613(2016)Fluorescence probes to detect lipid-derived radicals.

2)　Enoki et al., Chem.Commun.,53,10922～10925(2017)Lipid radicals cause light-induced retinal 

   　degeneration.

3)　Ishida et al., Free Radical Biol.Med.,113,1487～493(2017)Detection and inhibition of lipid-derived 

   　radicals in low-density lipoprotein.

4)　Mishima et al., J.Am. Soc.Nephrol.,31,280～296 (2020)Drug Repurposed as antiferroptosis agents 

   　suppress organ damage, including AKI, by functioning as lipid peroxyl radical scavengers.

5)　Matsuoka et al.,Anal. Chem.,92,6993～7002(2020)Method for Structural Determination of Lipid-

   　Derived Radicals.

◆參考數(shù)據(jù)

脂質(zhì)自由基特異性熒光光譜

添加花生四烯酸（AA）和Lipoxygenase（LOX）至LipiRADICAL Green，觀察470 nm的激發(fā)熒光。在未添加LOX的條件下，幾乎沒有觀察到熒光，而添加LOX并產(chǎn)生脂質(zhì)自由基后，可觀察到500-650 nm范圍內(nèi)的熒光（大540 nm附近）（左）。由此看出，熒光強(qiáng)度取決于添加的LOX濃度（右）。

自由基特異性

觀察在以下條件中添加各試劑至LipiRADICAL Green的熒光強(qiáng)度（激發(fā)470 nm/熒光530 nm）。可觀察到活性氧中的熒光幾乎沒有變化，而通過LOX酶或氧化誘導(dǎo)物質(zhì)（AAPH和MeO-AMVN）的3種脂質(zhì)產(chǎn)生的脂質(zhì)自由基產(chǎn)生時(shí)的熒光強(qiáng)度有所上升。

H₂O₂, ClO^- , KO₂（O₂^-?）,?OH ：0.5 mM Lipids 0.5 mM (LA: linoleic acid, ALA: α-linoleic acid, AA: arachidonic acid ) + LOX 2.5 μg/mL or AAPH 10 mM or MeO-AMVN 50 μM

◆應(yīng)用數(shù)據(jù)

活細(xì)胞成像

添加LipiRADICAL Green（1 μM）至Hepa1-6細(xì)胞培養(yǎng)20 min后，追加致癌性亞硝胺化合物DEN（30 mM）培養(yǎng)20 min，然后每隔2 min用激光共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行活細(xì)胞成像（激發(fā)458 nm/熒光490-674 nm）。經(jīng)DEN處理的細(xì)胞在添加試劑后，熒光強(qiáng)度立即隨培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)的增加而增加，這表明DEN是按順序產(chǎn)生脂質(zhì)自由基的。熒光顯微鏡圖像為添加試劑后20 min內(nèi)的數(shù)據(jù)。

體外檢測(cè)LDL來(lái)源的脂質(zhì)自由基

用氧化誘導(dǎo)物質(zhì)Hemin或AAPH處理純化的低密度脂蛋白LDL（20 μg protein/mL），添加LipiRADICAL Green（10 μM）并觀察1 h內(nèi)的熒光強(qiáng)度（激發(fā)470 nm/熒光530 nm），可檢測(cè)到Hemin、AAPH隨時(shí)間推移和試劑濃度依賴性熒光強(qiáng)度的增加，出現(xiàn)了不同的增加趨勢(shì)。

脂質(zhì)自由基結(jié)構(gòu)分析

1）評(píng)價(jià)由氧化誘導(dǎo)劑（AAPH + Hemin）產(chǎn)生的自由基

體外添加LOX（10 μg/mL）和氧化誘導(dǎo)物質(zhì)AAPH+Hemin（10 μM）至花生四烯酸（AA）中，誘導(dǎo)脂質(zhì)自由基后添加LipiRADICAL Green并進(jìn)行檢測(cè)反應(yīng)。之后通過Bligh＆Dyer法純化脂質(zhì)成分，并用熒光LC/MS-MS對(duì)AA產(chǎn)生的自由基進(jìn)行全面分析。

上圖：熒光LC色譜（激發(fā)470 nm/熒光530 nm）。檢測(cè)出多個(gè)峰，對(duì)各個(gè)峰進(jìn)行MS-MS分析。

下圖：用MS-MS分析比較經(jīng)鑒定的各種脂質(zhì)自由基生成量（注：用各自由基種類的LC峰面積的相對(duì)定量）。鑒定

          出8種類型的AA過氧化脂質(zhì)自由基（圓圖中的紅線），此外還鑒定了由AA裂解產(chǎn)生的29種脂質(zhì)自由基（條

          形圖、綠線）。

* 有關(guān)詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案和分析方法，請(qǐng)參閱原著論文5。

2）DEN誘導(dǎo)時(shí)內(nèi)源性產(chǎn)生的脂質(zhì)自由基檢測(cè)

向小鼠施以致癌性亞硝胺化合物DEN，分別在1 h、4 h、24 h后進(jìn)行麻醉，向腹腔內(nèi)施以LipiRADICAL Green，之后切除肝臟并壓碎，用Bligh＆Dyer法制備脂質(zhì)提取液。并用熒光LC/ MS對(duì)各提取物進(jìn)行各脂質(zhì)自由基的鑒定以及相對(duì)定量。另外，NBD-Pen給藥前15 min先施以脂質(zhì)自由基抑制劑OH-Pen。可觀察到左圖所示的熒光LC色譜圖，用MS/MS分析鑒定出共計(jì)11種類型的脂質(zhì)自由基。隨時(shí)間觀察各脂質(zhì)自由基種類（右圖為C₅H₁₁的檢測(cè)結(jié)果），可觀察到DEN給藥4 h后質(zhì)譜峰面積大幅增加，而24 h后減少。LipiRADICAL Green給藥前，經(jīng)OH-Pen處理的小鼠脂質(zhì)自由基被明顯抑制。

* 有關(guān)詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案和分析方法，請(qǐng)參閱原著論文5。

3）使用本試劑進(jìn)行體外鑒定脂質(zhì)自由基

使用本試劑從5種PUFA【亞油酸（LA），α-亞麻酸（ALA），花生四烯酸（AA），二十二碳六烯酸（DHA），二十碳五烯酸酯（EPA）】中經(jīng)LOX、AAPH以及Hemin處理后鑒定的脂質(zhì)自由基列表如下（摘自原著論文5）。

通過OH-Pen抑制亞硝胺誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌

向大鼠施以致癌性亞硝胺化合物DEN后，1 h后再施以O(shè)H-Pen。分別切除慢性模型12周后和急性模型24 h后的大鼠肝臟。

上圖：慢性模型的肝癌。DEN給藥使惡性腫瘤亢進(jìn)，而施以O(shè)H-Pen可明顯抑制該反應(yīng)。

中圖：急性模型LPO代謝產(chǎn)物的定量評(píng)價(jià)。發(fā)現(xiàn)OH-Pen抑制了DEN引起的MDA、4-HNE及Acrolein這三種LPO下

          游產(chǎn)物的增加。

下圖：急性模型組織損傷標(biāo)記物的定量評(píng)價(jià)。發(fā)現(xiàn)OH-Pen抑制了DEN引起的8-OHdG、ALT及細(xì)胞凋亡量的增

          加。

這些結(jié)果顯示，DEN引起LPO亢進(jìn)并產(chǎn)生脂質(zhì)自由基后會(huì)誘導(dǎo)各種毒性信號(hào)，但OH-Pen可通過抑制初期脂質(zhì)自由基連鎖反應(yīng)來(lái)抑制癌變。

◆產(chǎn)品列表