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內(nèi)毒素污染對(duì)基因治療和細(xì)胞治療的影響
閱讀：284 發(fā)布時(shí)間：2022-9-27
基因療法正在*改變我們治療人類疾病的方式。任何通過(guò)修改個(gè)人基因來(lái)治療或治愈疾病的技術(shù)都被認(rèn)為是基因療法的形式之一。這些技術(shù)可以通過(guò)幾種潛在的機(jī)理實(shí)現(xiàn)。一個(gè)基因的致病之處可能被滅活，或被健康的版本所取代，又或者是引進(jìn)一個(gè)新的基因來(lái)對(duì)抗一種疾病。基因治療產(chǎn)品是通過(guò)將遺傳物質(zhì)引入細(xì)胞核而發(fā)揮作用的。為了引入遺傳物質(zhì)，科學(xué)家需要一個(gè)可將基因、核酸酶或短發(fā)夾RNA（shRNA）運(yùn)送到人體細(xì)胞核的運(yùn)輸系統(tǒng)。攜帶這種遺傳物質(zhì)的運(yùn)輸工具被稱為載體1。
應(yīng)用于基因治療的載體多種多樣，可分為病毒型和非病毒型。病毒載體是目前美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)的基因療法中使用的載體，而非病毒技術(shù)作為一種安全有效地將遺傳物質(zhì)運(yùn)送給細(xì)胞以達(dá)到治療效果的方法正在研究當(dāng)中1。但與非病毒載體相比，病毒載體的基因轉(zhuǎn)移效率高10倍至1000倍。然而我們應(yīng)該意識(shí)到，基于非病毒載體的基因療法安全水平高且生產(chǎn)成本低，具有非常高的吸引力，在未來(lái)的藥物開(kāi)發(fā)中具有很大的潛力5。
目前最常見(jiàn)的兩種載體是質(zhì)粒和病毒。質(zhì)粒是細(xì)胞內(nèi)的一種小型染色體外DNA分子，與染色體DNA物理分離，可以獨(dú)立復(fù)制。最常以小型環(huán)狀雙鏈DNA分子的形式出現(xiàn)在細(xì)菌中，但有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)在古細(xì)菌和真核生物中。在自然界中發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒，往往攜帶著有利于生物體生存的基因，并能提供獨(dú).特的優(yōu)勢(shì)，例如對(duì)抗生素的強(qiáng)烈抗性。染色體很大，并且含有在“正常條件“下生活的全部基本遺傳信息，而質(zhì)粒通常很小，只含有在某些壓力、逆境或疾病狀態(tài)下才可能發(fā)揮作用的額外基因2。另一方面，由病毒載體包裝的基因可以整合到宿主細(xì)胞的基因組中并永.久表達(dá)。一些類型的病毒可將其基因組插入宿主的細(xì)胞質(zhì)中，但實(shí)際上并沒(méi)有進(jìn)入細(xì)胞，而另一些病毒會(huì)偽.裝成可穿透細(xì)胞膜的蛋白分子，進(jìn)而很容易地進(jìn)入細(xì)胞。可能發(fā)生的病毒性感染主要有兩種類型，一種被稱為裂解性感染，另一種為溶源性感染。裂解循環(huán)的病毒在插入其DNA后不久就迅速產(chǎn)生更多的病毒，隨后從細(xì)胞中迸發(fā)出來(lái)，繼續(xù)感染越來(lái)越多的細(xì)胞。溶源性病毒則是將其DNA整合至宿主細(xì)胞的DNA后，在對(duì)某個(gè)觸發(fā)因素作出反應(yīng)前可在體內(nèi)存活多年。病毒會(huì)像細(xì)胞一樣繁殖，并且不會(huì)對(duì)所依賴的宿主造成任何傷害，直至被某種方式觸發(fā)。一旦被觸發(fā)，病毒就會(huì)從宿主的DNA中釋放出來(lái)，以此創(chuàng)造新的病毒3。
最早應(yīng)用于基因治療的病毒載體是以腺病毒為基礎(chǔ)的，腺病毒會(huì)引起普通感冒以及人類呼吸道、腸道和眼部感染1。腺病毒以雙鏈DNA的形式攜帶遺傳物質(zhì)。當(dāng)進(jìn)入宿主細(xì)胞時(shí)，這種遺傳物質(zhì)可短暫存在于細(xì)胞核中，因此能夠像其他基因一樣自由進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。并且，人們發(fā)現(xiàn)腺病毒會(huì)在患者體內(nèi)引發(fā)強(qiáng)烈的、具有潛在危險(xiǎn)的免疫反應(yīng)，因此，使用該類型病毒進(jìn)行基因治療的研究仍在繼續(xù)3。逆轉(zhuǎn)錄病毒、單純皰疹病毒等其他病毒載體也已被使用。
基因治療產(chǎn)品與所有人體治療藥物一樣，關(guān)鍵在于不受內(nèi)毒素污染。內(nèi)毒素，也被稱為脂多糖（lipopolysaccharide）或LPS，是革蘭氏陰性細(xì)菌外細(xì)胞膜的一種成分。作為一種強(qiáng)力的熱原，微量接觸也會(huì)導(dǎo)致危險(xiǎn)的發(fā)燒甚至敗血癥。此外，內(nèi)毒素具有高度的耐熱性，很難通過(guò)傳統(tǒng)的方法來(lái)清除。
根據(jù)FDA管理指南，所有靜脈注射藥品的內(nèi)毒素含量必須低于5 EU每公斤體重。但內(nèi)毒素普遍存在于環(huán)境，實(shí)驗(yàn)室也不例外，因此，基因治療產(chǎn)品在用于人體測(cè)試前進(jìn)行內(nèi)毒素污染測(cè)試是至關(guān)重要的。
2019年發(fā)表于《Molecular Therapy – Methods & Clinical Development 》的一篇論文測(cè)試了一種從重組腺相關(guān)病毒（rAAV，一種常見(jiàn)的基因治療載體）原液中去除內(nèi)毒素污染的新方法。大腸桿菌通常是內(nèi)毒素污染的來(lái)源，rAAV便是由大腸桿菌中分離出來(lái)的質(zhì)粒DNA制備而來(lái)。8
該作者使用LAL（美洲鱟試劑）檢測(cè)法來(lái)定量?jī)?nèi)毒素水平。清除rAAV原液的挑戰(zhàn)之一是任何殘留的洗滌劑都會(huì)引起毒性，還會(huì)干擾LAL檢測(cè)試劑，從而導(dǎo)致假陰性。其原因在于掩蔽效應(yīng)，即脂多糖分子被洗滌劑分子包圍，無(wú)法與LAL試劑相互作用。因此，作者將洗凈原液中的洗滌劑水平保持在臨界值以下，以便于使用LAL精準(zhǔn)地檢測(cè)內(nèi)毒素。8
這項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)了*凈化基因治療產(chǎn)品的重要性，以及為了去除殘留的洗滌劑而進(jìn)行嚴(yán)格的交換緩沖液沖洗的必要性。隨著基因治療的普及，科學(xué)家們?nèi)皂氁庾R(shí)到內(nèi)毒素污染潛在危險(xiǎn)的重要性，以及需要避免由于洗滌劑殘留而造成假陰性結(jié)果。8
與基于基因療法的治療方法一樣，細(xì)胞治療產(chǎn)品也需要考慮可能受到污染的問(wèn)題。細(xì)胞治療產(chǎn)品包括細(xì)胞免疫療法、癌癥疫苗和應(yīng)用于某些治療適應(yīng)癥的其他類型自體或異體細(xì)胞，如造血干細(xì)胞和成人及胚胎干細(xì)胞。基因治療是通過(guò)蛋白載體或載體將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到合適的細(xì)胞中，而細(xì)胞治療是將具有相關(guān)和必要功能的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到患者體內(nèi)。4,6
在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中培養(yǎng)任何一種類型的細(xì)胞時(shí)，所面臨的首要問(wèn)題始終是避免污染。生物污染往往是工作的重點(diǎn)，同時(shí)也是最容易檢測(cè)和避免的。
例如，大多數(shù)細(xì)菌或真菌污染在細(xì)胞培養(yǎng)基中肉眼可見(jiàn)，并可以使用抗生素處理來(lái)預(yù)防。而支原體或其他細(xì)胞系等其他生物污染物則更難檢出，但仍可通過(guò)市面上的檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。
化學(xué)污染與生物污染相比，受到的關(guān)注相對(duì)較少，并且更難檢測(cè)和避免。其中，最隱蔽的化學(xué)污染物就是內(nèi)毒素。潛在的內(nèi)毒素污染源包括水、細(xì)胞培養(yǎng)基、血清、玻璃制品和塑料制品。正如本文在基因治療產(chǎn)品部分中所提及，細(xì)胞治療中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)毒素對(duì)高壓滅菌和輻照都有很強(qiáng)的耐受力，這意味著它們可以在沒(méi)有活細(xì)菌的情況下存在。其高疏水性也使其對(duì)塑料制品具有很強(qiáng)的親和力，而且內(nèi)毒素與活細(xì)菌不同，在細(xì)胞培養(yǎng)基無(wú)法通過(guò)肉眼確認(rèn)。此外，內(nèi)毒素不能用抗生素去除，需要使用專門的內(nèi)毒素清除溶液。
采取措施避免內(nèi)毒素引起的細(xì)胞培養(yǎng)問(wèn)題，可以使研究人員對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果更有信心。為了幫助保持細(xì)胞培養(yǎng)物及其產(chǎn)生的療法不受內(nèi)毒素的污染，人們已提出了多種解決方法。其中，包括使用高純度的水和低內(nèi)毒素的FBS，以及使用經(jīng)認(rèn)證為無(wú)內(nèi)毒素的塑料器皿。7 然而，除了使用純化的原材料和試劑外，建立強(qiáng)大的無(wú)菌技術(shù)和滅菌程序，對(duì)減少內(nèi)毒素污染的幾率而言也非常重要。
無(wú)菌技術(shù)是每一位生物研究人員必須掌握的核心技能之一。為避免出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)偽像和潛在的細(xì)胞死亡，有必要防止細(xì)胞培養(yǎng)物的污染。此外，動(dòng)物研究中的污染也可能導(dǎo)致感染或死亡。
大多數(shù)生物污染物可以使用漂白劑或乙醇等標(biāo)準(zhǔn)的消毒試劑來(lái)避免，但內(nèi)毒素高度穩(wěn)定，在沒(méi)有活菌的情況下也能繼續(xù)存在。因此，對(duì)于質(zhì)控技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，保持嚴(yán)格的無(wú)菌技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)操作程序至關(guān)重要。
定期更換手套是內(nèi)毒素相關(guān)無(wú)菌技術(shù)的示例之一。沒(méi)有經(jīng)驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)員可能認(rèn)為經(jīng)常用乙醇噴灑手套就足以保持無(wú)菌狀態(tài)，但乙醇可能會(huì)帶來(lái)內(nèi)毒素污染，因此，應(yīng)為使用者制定更換手套的頻率標(biāo)準(zhǔn)。
內(nèi)毒素污染會(huì)極大地影響體外實(shí)驗(yàn)，特別是涉及免疫細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)。巨噬細(xì)胞對(duì)內(nèi)毒素的反應(yīng)表現(xiàn)為IL-6分泌增加，而T細(xì)胞的表現(xiàn)為增殖和淋巴因子的產(chǎn)生增加。
受到內(nèi)毒素的影響，非免疫細(xì)胞也可能會(huì)失調(diào)。傳統(tǒng)上認(rèn)為內(nèi)毒素是通過(guò)CD14受體起作用的，但缺乏這種受體的細(xì)胞仍可對(duì)內(nèi)毒素污染表現(xiàn)出強(qiáng)烈的反應(yīng)。例如，一項(xiàng)研究報(bào)告指出，心肌細(xì)胞在暴露于內(nèi)毒素時(shí)，會(huì)出現(xiàn)收縮功能障礙。其他研究也報(bào)告了CHO細(xì)胞內(nèi)蛋白產(chǎn)生的改變以及輸尿管上皮細(xì)胞中克隆效率的改變。
此外，不同的細(xì)胞系對(duì)內(nèi)毒素污染的靈敏程度差異巨大。一些細(xì)胞系在內(nèi)毒素低于1 ng/mL的情況下即表現(xiàn)失調(diào)，而其他細(xì)胞系則需要高達(dá)5000 ng/mL的濃度。也有理論認(rèn)為，在培養(yǎng)中生長(zhǎng)多年的細(xì)胞系（如HeLa和CHO細(xì)胞）可能隨著時(shí)間的推移被自然選擇為耐內(nèi)毒素。基于這一點(diǎn)，很難確定一個(gè)廣泛適用的內(nèi)毒素污染安全閾值。
進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，購(gòu)買低含量?jī)?nèi)毒素產(chǎn)品是至關(guān)重要的。然而，內(nèi)毒素污染可能在打開(kāi)試劑后產(chǎn)生，或在玻璃器皿/塑料器皿中轉(zhuǎn)移污染，因此定期進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)顯得十分重要。
對(duì)于基因治療和細(xì)胞治療產(chǎn)品來(lái)說(shuō)，鱟試劑（LAL）檢測(cè)法為量化內(nèi)毒素水平提供了一個(gè)兼具成本效益和高靈敏度的選擇。本檢測(cè)法依賴于從鱟血液中提取的蛋白，這些蛋白在內(nèi)毒素存在的情況下發(fā)生凝結(jié)反應(yīng)，可以對(duì)其定量以獲取高度準(zhǔn)確的內(nèi)毒素水平讀數(shù)。在維護(hù)我們的基因和細(xì)胞治療的安全性方面，特別是應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)以及重要的體外實(shí)驗(yàn)時(shí)，這種檢測(cè)方法將會(huì)繼續(xù)發(fā)揮關(guān)鍵作用。
◆相關(guān)產(chǎn)品
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◆參考文獻(xiàn)
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Lisa Komski
Lisa Komski是FUJIFILM Wako Chemicals U.S.A. Corporation LAL部門的銷售總經(jīng)理。在化學(xué)和生命科學(xué)行業(yè)擁有近30年的職業(yè)生涯，是美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）要求和cGMP方面的業(yè)務(wù)發(fā)展專業(yè)人士。Lisa擁有生物學(xué)和醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)位。
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