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cellendes 3D細(xì)胞水凝膠系統(tǒng)使用操作步驟
點(diǎn)擊次數(shù)：6910 發(fā)布時(shí)間：2015-11-17
德國(guó)cellendes的3D細(xì)胞水凝膠系統(tǒng)是一套用于3D細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)構(gòu)建細(xì)胞外基質(zhì)組分的試劑。使用者可以利用這些試劑控制細(xì)胞外環(huán)境，設(shè)計(jì)適合細(xì)胞生存的3D系統(tǒng)。
3D細(xì)胞水凝膠系統(tǒng)與活體細(xì)胞外基質(zhì)相似，采用該系統(tǒng)可使體外細(xì)胞培養(yǎng)更接近體內(nèi)的生理特征，是基礎(chǔ)研究、藥物篩選和再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域細(xì)胞功能研究的理想選擇。
一、使用cellendes 3D細(xì)胞水凝膠系統(tǒng)時(shí)的注意事項(xiàng)：
1. 所有步驟均在無菌環(huán)境下操作。
2. 一般選擇使用10x CBpH 5.5，10x CBpH 5.5不適合時(shí)，才會(huì)使用10x CBpH 7.2 。但是使用10x CBpH 7.2時(shí)，凝膠形成的速度很快，降低CB的pH值，可以減緩凝膠形成的速度，可以混合10x CBpH 5.5和10x CBpH 7.2 。
CBpH 5.5和CBpH 7.2混合后CB的pH值（詳見說明書p10）
3. 細(xì)胞懸液： PBS或培養(yǎng)基懸液
4. Mal-PVA或Mal-Dextran溶解后冰浴上使用。溶解后應(yīng)放于-80℃保存，使用時(shí)避免反復(fù)凍融，如果短期內(nèi)使用，可以4℃放置（1周左右）
5. PEG-link和CD-link不要長(zhǎng)時(shí)間暴露在空氣中
二、使用cellendes 3D細(xì)胞水凝膠系統(tǒng)時(shí)實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：
1. 解凍、溶解3D水凝膠組分（詳見說明書），保證全部溶解
2. 如果3D水凝膠需添加RGD肽（詳見說明書）：
A. 用水溶解RGD肽，使終濃度是3.0mmol/L
B. 如需比較RGD肽不同濃度的效果，會(huì)使用硫代甘油，需將硫代甘油：水=1：6.7溶解，使終濃度是3.0mmol/L
3. 保證Mal-PVA或Mal-Dextran 冰浴上
4. 準(zhǔn)備細(xì)胞懸液（PBS或培養(yǎng)液），建議細(xì)胞懸液濃度時(shí)2-4 x106/ml，使zui終濃度時(shí)10000-20000個(gè)細(xì)胞/30ul
三、無RGD肽時(shí)cellendes 3D細(xì)胞水凝膠系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)操作：
注：需保證馬來酰亞胺基團(tuán)（Mal- ）和硫醇基團(tuán)（SH- ）等量
可以預(yù)實(shí)驗(yàn)決定凝膠強(qiáng)度
注：CBpH5.5和細(xì)胞懸液的量是不變的，為了保證等滲條件
實(shí)驗(yàn)步驟如下：
A．按上表混合水、CBpH5.5、Mal-PVA(或Mal-Dextran)、細(xì)胞懸液于一管（管1）中
B．將PEG-link(或CD-link)滴加到培養(yǎng)皿表面
C. 用吸頭吸出管1中的組分，與培養(yǎng)皿上的PEG-link(或CD-link)混合，快速吹打3-4次
D. 避免產(chǎn)生氣泡，放置至少一分鐘（3-5min），等待凝膠形成
E. 一旦凝膠形成，輕輕加培養(yǎng)液至覆蓋住凝膠，蓋上培養(yǎng)皿蓋，至合適的溫度孵育
F. 兩個(gè)小時(shí)后更換新培養(yǎng)基
四、用RGD肽時(shí)cellendes 3D細(xì)胞水凝膠系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)操作：
一般情況下1mmol/l或低于1mmol/l的RGD肽，就可以提供足夠的粘附力
當(dāng)需比較RGD肽濃度以及是否需要使用RGD肽時(shí)，需用到硫代甘油
下表中列舉的是：馬來酰亞胺基團(tuán)（Mal--）=硫醇基團(tuán)（SH--）=5mmol/l，選擇zui合適RGD肽濃度時(shí)，需用硫代甘油來調(diào)節(jié)
如確定交聯(lián)強(qiáng)度是5mmol/l，可按下表預(yù)實(shí)驗(yàn)RGD肽濃度
實(shí)驗(yàn)步驟如下：
實(shí)驗(yàn)操作示意圖（30ul體系）
A. 按上表混合水、CBpH5.5、Mal-PVA(或Mal-Dextran)、細(xì)胞懸液于一管（管1）中
B. 添加RGD肽和硫代甘油于管1中，快速混勻，室溫放置5-10min，有足夠的時(shí)間使RGD peptide共價(jià)結(jié)合到馬來酰亞胺基團(tuán)（Mal- ）上
C. 將PEG-link(或CD-link)滴加到培養(yǎng)皿表面
D. 將細(xì)胞懸液添加到管1中
E. 用吸頭吸出管1中的組分，與培養(yǎng)皿上的PEG-link(或CD-link)混合，快速吹打3-4次
F. 避免產(chǎn)生氣泡，放置至少一分鐘（3-5min），等待凝膠形成
G. 一旦凝膠形成，輕輕加培養(yǎng)液至覆蓋住凝膠，蓋上培養(yǎng)皿蓋，至合適的溫度孵育
H. 兩個(gè)小時(shí)后更換新培養(yǎng)基
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