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熒光PCR檢測進入“分鐘”級時代：百泰克23分鐘RNA檢測技術
閱讀：1619 發布時間：2022-9-1新冠疫情的爆發，使得全球卷入了這場沒有硝煙的戰斗中。
等溫擴增
核酸檢測是確診 SARS-CoV-2 感染的最主要依據。目前可用于 RNA 病毒的核酸檢測技術主要有基因測序、聚合酶鏈式反應（PCR）、等溫核酸擴增等。其中熒光定量PCR檢測方法是*方案。
然而反轉錄實時熒光定量 PCR（RT-qPCR）的檢測方法需要依賴溫控精度良好的熱循環儀，并且PCR反應中必須的變性、退火和延伸步驟，使整個擴增檢測時間較長，難以實現對SARS-CoV-2的現場快速檢測。
核酸等溫擴增技術無需熱循環儀，擴增反應效率高、速度快，非常適合于病原體核酸的現場快速檢測。因此不少相關從業人員，都曾把核酸快速檢測的希望，寄托于等溫擴增技術上面。
不同等溫擴增技術優劣
不少核酸等溫擴增方法已相繼被用于SARS-CoV-2的檢測。包括依賴核酸序列的擴增技術（NASBA）、重組酶聚合酶擴增技術（RPA）、環介導等溫擴增技術（LAMP）、交叉引發擴增技術（CPA）、切刻內切酶核酸擴增反應（NEAR）等。
這些技術原理各異，產物檢測方法各不相同，造成它們在檢測SARS-CoV-2時的靈敏度、特異性、靶標基因、所需儀器、檢測時間等方面存在差異。
下圖所示是已經獲得國家藥監局批準的主要的核酸等溫擴增檢測核酸技術，及其相關情況：
數據來源：馬學軍5
市面上這幾種等溫擴增的方法各有優缺點，以下來分析
SAT是在 NASBA 技術的基礎上，進一步提高了檢測的靈敏度和特異性，但是并未能從根本上克服NASBA 技術反應時間長的問題。
熒光RT-RAA法：熒光RAA方法靈敏度較高。但是對樣品核酸品質要求較高，需要搭配傳統的提取方法。并且樣品同一時間只能檢測單一靶標基因。
CPA實時熒光法：CPA擴增產物采用分子信標進行檢測，然而這個方法的通量太小。此外交叉引物的設計要求較高，在研發過程中，引物的篩選和測試，十分繁瑣。這可能會造成基于該技術的檢測試劑平臺開發周期較長。
LAMP芯片法：可利用肉眼觀察顏色變化，或灰度檢測來判讀檢測結果，雖然降低了對儀器設備的要求，適合在資源有限和經濟不發達地區開展核酸檢測，然而主觀判斷顏色變化存在較大個體差異，有可能影響結果判讀。
此外國外，曾經有相關研究人員就病毒檢測，針對LAMP 實驗方法，以及商品化新冠檢測試劑盒的作一個對比，對不同濃度的陽性樣品進行檢測對比，結果如下表所示:
結果顯示在中低濃度的陽性樣品中，LAMP法與熒光定量PCR對比，陽性檢出率較低，而且檢測下限也較差。
除了上述提到的情況外，等溫擴增還有以下一些問題
1、樣品前處理（核酸提取）是等溫擴增一個主要制約因素。
2、如何實現單管閉管條件下的多重或多靶標等溫擴增檢測，并同時具有高靈敏度和特異性，也是亟待解決的技術難題。
3、在理論上等溫擴增技術不能夠通過反應時間來指示核酸擴增量，這難以實現精準的定量檢測，更加適合于半定量或定性檢測。
4、某些等溫擴增方法，如 LAMP 等溫擴增涉及多個引物，往往需要通過優化引物設計來確保核酸檢測的特異性與靈敏度，這提高了其技術實現難度。
現階段而言，某些等溫擴增技術具有一定現場應用的前景，然而目前的產品通量偏低，時間偏長和靈敏度偏低，還是限制了這項技術的應用場景。這些缺點限制了等溫擴增的發展，也造成了等溫擴增技術空有好的設想卻遲遲無法落地的困境。
那有沒有既兼具了等溫擴增快速、儀器簡單的特點，而又有傳統熒光定量PCR特異性好、準確度高的檢測方法？答案是有的。快速熒光定量PCR就是這個問題的解決方法。它既有傳統熒光定量PCR準確度高，靈敏度好的特點，而又通過技術革新，具備比等溫擴增更快速完成實驗的能力。
革新
傳統的熒光定量PCR實驗時間長，是由于受到儀器升降溫速度，以及傳熱的效率所限，整個實驗時間時長一般為70-120分鐘。
一般來說，熒光定量PCR反應的溫度條件是較為固定的，既然無法改變溫度條件，若想提高整個實驗的速度，那么只能從兩方面著手進行優化：一是提升溫控性能，二是提高熱傳遞效率。
百泰克快速熒光定量PCR儀BTK-8，采用先進的升降溫模塊，升降溫可達12℃/s，平均升降溫速度為10℃/s，為傳統熒光PCR儀的3-5倍。由于變溫PCR反應時，溫度需要從58℃提升至95℃，再降至58℃，如此循環40~45次，因此升降溫速率的提升可將原本70-120min的檢測提速至20~30min完成。
耗材方面，BTK-8摒棄了傳統的0.1ml、0.2ml PCR反應管，采用新型的注塑工藝與柔性膜結合技術，研發芯片式反應耗材，適合大規模機械化生產，成本進一步降低。
單個芯片包含有10個獨立的樣品孔，芯片加樣孔較小，不容易與空氣進行交換，從而大大降低了孔洞間的氣溶膠交叉污染的可能性，檢測體系具有超高的檢測準確性，可達到ABI Q6同等靈敏度，且芯片加樣無需離心去掉氣泡，操作起來更加便捷。
從下表可以看出，現在BTK-8這款快速定量PCR儀，已經能把實驗時間壓縮至30分鐘以下，而且檢測下限能夠達到200 copies/ml，能滿足現在的檢測需求。相比于等溫擴增技術，快速熒光PCR的時間更短、準確性更高。
結語
在過去的時間內，等溫擴增技術憑借其簡單快速、便于在基層單位推廣的特點，在部分人畜共患病、婦科惡性腫瘤、以及多種呼吸道疾病的檢測中發揮著一定的作用。然而伴隨著BTK-8快速熒光PCR儀的橫空出世，使得相關的檢測有了一個更好的選擇。能提供更快捷、準確實驗結果的快速熒光定量PCR儀，將會替代等溫擴增的檢測手段，在多個領域中發揮巨大作用。
特別是在病毒疫情仍然全球流行的時期，由于各國防控情況不平衡，病毒或將在相當長的一段時間內與人類共存，甚至有可能會成為一種長期存在的一種呼吸道傳播病原體。而在口岸快速排查，基層發熱門診快速分流的實際需求，均要求能夠提供快速、準確、有效的實驗檢測結果。相比于等溫擴增技術、BTK-8快速熒光PCR儀則更能滿足這些場景的需求。