黃曲霉毒素（Aflatoxins, AF）是一類由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，具有誘發(fā)人體致畸、致癌、致突變的作用，主要的污染物有黃曲霉毒素B1, B2, G1, G2。中藥材大多以天然植物為基源，在儲(chǔ)存不當(dāng)或因其他外界條件影響時(shí)，易受霉菌污染產(chǎn)生黃曲霉毒素。因此對(duì)中藥材進(jìn)行黃曲霉毒素的高效便捷檢測是十分有必要的。

參考2020年版《中國藥典》四部通則中《2351 真菌毒素測定法 黃曲霉毒素測定法》黃曲霉毒素法，試樣經(jīng)過70%甲醇水提取，提取液經(jīng)稀釋、離心后，使用Raykol Fotector Plus高通量全自動(dòng)固相萃取儀，濾液自動(dòng)化經(jīng)過含有黃曲霉毒素特異抗體的免疫親和柱凈化和富集后，目標(biāo)化合物通過帶有三重四級(jí)桿質(zhì)譜檢測器的高效液相色譜儀進(jìn)行測定，建立了中藥材中黃曲霉毒素高靈敏度的前處理和分析方法，并進(jìn)行三種常見中藥材（陳皮、人參、當(dāng)歸）中黃曲霉毒素的加標(biāo)回收驗(yàn)證，平均回收率在84.5~101.3%之間，RSD小于10%。

2.儀器、耗材

儀器

Raykol Fotector Plus 高通量全自動(dòng)固相萃取儀

Raykol Auto EVA-60 全自動(dòng)平行濃縮儀

Raykol AH-30 全自動(dòng)均質(zhì)器

Raykol Auto Prep 200 全自動(dòng)液體樣品處理工作站

高效液相色譜（HPLC）：Agilent 1200

質(zhì)譜檢測器 (MS)：Agilent 6430

耗材

黃曲霉毒素免疫親和柱

試劑

緩沖液：稱取25 g氯化鈉、5 g碳酸氫鈉溶于水中，加入0.1 mL吐溫-20，用水稀釋至1000 mL即得淋洗緩沖液。

使用Auto Prep 200全自動(dòng)液體樣品處理工作站配制黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，具體配制方法如圖-1所示：

圖-1 Auto Prep 200 黃曲霉毒素混合溶液配制方法

空白基質(zhì)溶液用Auto EVA -60全自動(dòng)平行濃縮儀氮吹后，分別加入1 mL上述混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液復(fù)溶，過0.22 μm的有機(jī)相濾膜后配制成基質(zhì)混合工作溶液，供液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定。 

3.樣品提取與前處理

陳皮、人參、當(dāng)歸試樣前處理

準(zhǔn)確稱取15 g試樣于120 mL離心管中，加入3 g氯化鈉及75 mL甲醇-水溶液（7:3，V/V），12000轉(zhuǎn)/分鐘攪拌速度下均質(zhì)2 min，離心5 min（轉(zhuǎn)速4000 r/min）。準(zhǔn)確量取15 mL上層提取液于50 mL容量瓶中，用水定容、取30 mL至50 mL離心管中, 離心10 min（轉(zhuǎn)速4000 r/min），后準(zhǔn)確移取20 mL上清液至80 mL玻璃上樣管，待凈化用。

固相萃取凈化條件

凈化方法

凈化過程采用黃曲霉毒素免疫親和柱進(jìn)行富集凈化，具體方法如下：

清洗樣品通道：用甲醇清洗；

上樣：采用2 mL/min的流速進(jìn)行精確上樣20 mL；

淋洗：采用緩沖液和純水進(jìn)行淋洗小柱；

氣推：用60 mL空氣將水?dāng)D出免疫親和柱；

洗脫：以0.5 mL/min的速度用甲醇進(jìn)行洗脫，開始收集溶液；

氣推：將柱子里溶液用空氣推出，收集溶液。

將收集液用甲醇定容至2 mL，混勻后過0.22 μm濾膜用液質(zhì)檢測。詳細(xì)步驟見圖-2。

圖-2 Fotector Plus黃曲霉毒素的免疫親和凈化方法

4.液質(zhì)聯(lián)用色譜圖

4種黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖

5.樣品測試

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

選擇定量離子的峰面積作為縱坐標(biāo)，濃度作為橫坐標(biāo)，做相關(guān)曲線，曲線為線性回歸，各點(diǎn)權(quán)重相等，擬合出工作曲線，要求R2>0.99。

基質(zhì)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

在陳皮、人參、當(dāng)歸3種常見樣品基質(zhì)中添加水平為1.8 μg/kg的黃曲霉毒素G2、B2和6.0 μg/kg的黃曲霉毒素G1、B1進(jìn)行加標(biāo)回收驗(yàn)證，平均回收率和RSD結(jié)果見下表：

表-1 平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (n=4)

6.總結(jié)

A.提取液需加入水進(jìn)行稀釋、定容至50 mL后才可進(jìn)行凈化，以防止過多的有機(jī)溶劑使免疫親和柱失活。

B.在人參和當(dāng)歸的凈化過程中，如采用20 mL水作為淋洗液，其加標(biāo)回收率為70~80%；而將10 mL的緩沖液和10 mL的純水作為淋洗液時(shí)，可除去免疫親和柱上殘留的色素和基質(zhì)，從而提高回收率。

C.進(jìn)行洗脫時(shí)甲醇的過柱流速控制在1滴/s為宜。洗脫效果不佳時(shí)，可采取讓甲醇浸泡免疫親和柱后再加以洗脫。

D.由于黃曲霉毒素在紫外光照射下不穩(wěn)定，因此在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)避免紫外光和太陽光的照射。

7.解決方案優(yōu)勢

通過高通量全自動(dòng)固相萃取儀進(jìn)行凈化和富集，能自動(dòng)化進(jìn)行免疫親和柱自動(dòng)脫帽和樣品上樣、淋洗和洗脫等過程，8種溶劑可選，6個(gè)樣品通道同時(shí)運(yùn)行，能連續(xù)、批量處理多樣品，實(shí)現(xiàn)高通量、自動(dòng)化固相萃取過程。

整體解決方案可實(shí)現(xiàn)樣品快速高效處理，提高工作效率。同時(shí)自動(dòng)化前處理解決方案可解放實(shí)驗(yàn)人員雙手，也避免有機(jī)溶劑的毒害。

配液

?？?/span> 全自動(dòng)液體樣品處理工作站

提取

?？?/span> 全自動(dòng)均質(zhì)器

濃縮

?？?/span> 全自動(dòng)平行濃縮儀

凈化富集

?？?/span> 高通量全自動(dòng)固相萃取儀