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可溶性凋亡基因sCD95（APO1/Fas） ELISA 試劑盒

閱讀：1179 發(fā)布時間：2013-6-19

sCD95（APO1/Fas） ELISA 試劑盒

用途：

人sCD95 ELISA 試劑盒用于體外定量檢測人血清、血漿、緩沖液或細(xì)胞培養(yǎng)液中的可溶性

CD95（APO-1, Fas）。本實驗可以檢測天然的和重組的sCD95。本試劑盒于研究，而非

用于診斷。

試驗原理：

sCD95 試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。抗sCD95 特異單克隆抗體包被

微孔板，已知sCD95 濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣本、對照樣本和未知樣本加入微孔進行檢測。

先將sCD95 抗原和生物素標(biāo)記的抗sCD95 特異單克隆抗體同時孵育。洗滌后，加入親和

素過氧化物酶。再經(jīng)過孵育和洗滌，去除未結(jié)合的酶，然后加入酶復(fù)合物的作用底物，產(chǎn)生

顏色反應(yīng)。顏色的深淺和樣本中sCD95 的濃度呈比例關(guān)系。

提供的試劑和配制方法：

試劑（2~8℃保存）	數(shù)量	色標(biāo)	配制
96 微孔板	1		即用型
塑料蓋板	2
標(biāo)準(zhǔn)品：3000pg/ml	2 支凍干粉	黃色	按標(biāo)簽要求以標(biāo)準(zhǔn)稀釋液稀釋
對照	2 支	銀色	按標(biāo)簽要求以標(biāo)準(zhǔn)稀釋液稀釋
標(biāo)準(zhǔn)稀釋緩沖液	1 支（25ml）	黑色	10X, 用蒸餾水稀釋
生物素標(biāo)記抗sCD95	1 支（0.4ml）	紅色	用生物素標(biāo)記抗體稀釋液稀釋
生物素標(biāo)記抗體稀釋液	1 支（13ml）	紅色	即用型
親和素HRP	2 支（5ul）		0.5mlHRP 稀釋液預(yù)稀釋
HRP 稀釋液	1 支（23ml）	紅色	即用型
洗滌液	1 支（10ml）	白色	200X, 用蒸餾水稀釋
TMB	1 支（24ml）		即用型
硫酸終止液	1 支（11ml）	黑色	即用型

試驗需要但未提供的用品：

?? 蒸餾水

?? 微量加樣器：10ul,50ul,100ul,200ul,1000ul

?? 旋渦振蕩器和磁力攪拌器

安全性：

?? 僅用于科研

?? 本試驗所用的人血成分均經(jīng)檢測，不含有HbsAg 和抗HIV 陽性物質(zhì)。盡管如此，無法

確保沒有傳播肝炎或艾滋病等的可能。因此處理這些血清、血漿樣本時，應(yīng)該遵守

有關(guān)的安全操作規(guī)程，例如CDC/NIH 健康手冊：“微生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)試驗中的安全”

/1984。

→ 避免硫酸和TMB 與皮膚接觸。如有接觸，可用水*沖洗。

→ 不可在使用試劑盒的地方吃飯、飲水、吸煙或化妝。

→ 不可用口吸取樣本。

操作要點/試驗室質(zhì)量控制：

1、使用前應(yīng)根據(jù)標(biāo)簽上指示冷藏。使用時所有試劑應(yīng)平衡至室溫。凍干標(biāo)準(zhǔn)品使用后

應(yīng)丟棄。

2、取出所需的孔條后，立即密封包裝，以防變質(zhì)。

3、不用時所有試劑要加蓋封好。

4、不同批號的試劑不可混用。

5、過期的試劑不可再用。

6、使用干凈的吸頭來吸取各種試劑、標(biāo)準(zhǔn)品、對照或樣本，以防交叉污染。吸取硫酸

或底物溶液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。

7、用干凈的塑料容器配備洗滌液。

8、使用前用振蕩器*混勻各種試劑。

9、微孔內(nèi)殘留液須充分吸干或在吸水紙上拍干，吸水紙不可插入孔內(nèi)吸水。

10、 TMB溶液是光敏的，避免長時光照。避免與金屬接觸產(chǎn)生顏色反應(yīng)。

警告：TMB 有毒，避免手直接接觸，并妥當(dāng)處理。

11、如配制后幾分鐘產(chǎn)生深蘭色，表明TMB 溶液被污染，必須棄去。在檢測完成

后一小時內(nèi)必須讀結(jié)果。

12、吸取樣本時，按順序逐孔加樣，以確保孵育時間相同。

13、孵育時間見操作規(guī)程。

14、在洗滌微孔板之后15 分鐘內(nèi)加入TMB 溶液。

樣品收集，處理和保存

1、細(xì)胞培養(yǎng)上清液——1000xg 離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。

2、血清——操作過程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液

后，1000xg 離心10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

3、血漿——EDTA，檸檬酸鹽和肝素血漿可用于檢測。1000Xg 離心30 分鐘去除顆粒。

4、保存——如果樣品不直接使用，將其分為小部分（250-500ul）-70℃下保存，避免

反復(fù)冷凍。如果可能，不要使用溶血和高脂血。如果血清中有大量的顆粒，檢測前

先離心或過濾。

注意：不要在37℃或56℃加熱解凍。在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

試劑準(zhǔn)備：

1、標(biāo)準(zhǔn)稀釋緩沖液

蒸餾水10 倍稀釋。

2、標(biāo)準(zhǔn)品

按標(biāo)簽要求以標(biāo)準(zhǔn)稀釋液配制，其濃度為3000pg/ml sCD95，可儲存。稀釋前輕輕

振蕩此標(biāo)準(zhǔn)品5 分鐘。每次實驗前將此標(biāo)準(zhǔn)品進行系列稀釋，不能保存。

3、對照

按標(biāo)簽要求以標(biāo)準(zhǔn)稀釋液配制。加樣前輕輕振蕩對照5 分鐘。稀釋后不能儲存。

4、生物素標(biāo)記抗sCD95 的稀釋

生物素標(biāo)記抗sCD95 用生物素標(biāo)記抗體稀釋液根據(jù)使用微孔數(shù)在干凈玻璃管中

稀釋。試驗時準(zhǔn)備。參見下表：

使用微孔數(shù)	生物素標(biāo)記的抗體（ul）	生物素標(biāo)記抗體稀釋液（ul）
16	40	1060
24	60	1590
32	80	2120
48	120	3180
96	240	6360

5、親和素HRP 的稀釋

在含5ul 親和素HRP 的瓶內(nèi)加入0.5ml HRP 稀釋液。本液為一次性使用。

根據(jù)使用微孔數(shù)在干凈玻璃管中進一步稀釋。參見下表：

使用微孔數(shù)	親和素HRP（ul）	HRP 稀釋液（ml）
16	30	2
24	45	3
32	60	4
48	75	5
96	150	10

6、洗滌緩沖液的稀釋

蒸餾水200 倍稀釋。

檢測方法：

1、試劑用前充分混勻，避免產(chǎn)生泡沫。

2、確定需要的微孔數(shù)，所有樣本、標(biāo)準(zhǔn)品、空白和對照樣本均要做雙份。

3、加100ul 配好的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液至標(biāo)準(zhǔn)孔B1,B2,C1,C2,D1,D2,E1,E2,F1,F2。（配制見前

述）吸取200ul 標(biāo)準(zhǔn)品加入A1,A2。（見下表）從A1,A2 中吸取100ul 至B1,B2 孔內(nèi)；

反復(fù)吸排，使之混合。重復(fù)此步驟，從B1,B2 至C1,C2，然后從C1,C2 至D1,D2 等等。

sCD95 標(biāo)準(zhǔn)稀釋液濃度由3000 至93.75pg/ml。從zui后的F1,F2 孔內(nèi)吸取100ul 棄掉。

4、加100ul 配好的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液至空白孔G1,G2。

5、加100ul 樣本至樣本孔和100ul 對照品至對照孔H1,H2。

6、配制生物素標(biāo)記的抗sCD95。（配制見前述）

7、加50ul 生物素標(biāo)記的抗sCD95 稀釋液于所有孔內(nèi)。

8、蓋上微孔板，室溫下（18 至25℃）孵育1 小時。

9、洗滌微孔板：① 吸去孔內(nèi)液

② 加0.3ml 洗滌液于各孔

③ 再吸去各孔內(nèi)液

④ 重復(fù)②和③二次

10、僅在用前配制HRP 液。（配制見前述）

11、加100ulHRP 液于各孔，含空白孔。加蓋。

12、室溫下孵育0.5 小時。

13、洗滌微孔板。（見步驟9）

14、加100ulTMB 底物液至各孔。室溫下避光孵育20 至30 分鐘。

15、通常根據(jù)ELISA 閱讀器確定孵育時間：許多ELISA 閱讀器僅讀數(shù)至2.0 O.D 值。

監(jiān)察O.D 值，應(yīng)在陽性結(jié)果衰褪前終止反應(yīng)。（不超過20 分鐘）

16、酶底物反應(yīng)用100ul 硫酸加入各孔內(nèi)終止。終止反應(yīng)后1 小時內(nèi)（這段時間在2

至8℃避光保存）或加入硫酸后立即讀取結(jié)果。

17、用分光光度儀讀數(shù)，450nm 作為初始波長，620nm（可以用610 至650nm）作為

參考波長。

建議微孔板編碼：

	標(biāo)準(zhǔn)濃度（pg/ml）		樣本孔
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	3000	3000
B	1500	1500
C	750	750
D	375	375
E	187.5	187.5
F	93.75	93.75
G	空白	空白
H	對照	對照

結(jié)果分析：

制作一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，平均光吸收值作Y 軸，對應(yīng)的sCD95 濃度作X 軸。各樣本中的sCD95

含量可根據(jù)樣本O.D 值通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定。

本試驗的局限性：

超過標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍（3000pg/ml）時，不可推測結(jié)果；樣本必須稀釋后再檢測。

本試驗的檢測特性：

1、敏感性：zui小檢測濃度低于47pg/ml。

2、準(zhǔn)確性：

批內(nèi)					批間
樣本	N	均值（pg/ml）	SD	CV%	樣本	N	均值（pg/ml）	SD	CV %
A	14	1719	106	6.1	A	8	1752	145	8.2
B	16	703	39	5.5	B	8	856	68	7.9

檢測程序小結(jié)：總時間 = 1 小時45 分鐘

加100ul 樣本或配好的標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ?/div>

加50ul 配好的生物素標(biāo)記的抗體于各孔內(nèi)

室溫孵育1 小時

洗3 次

加100ul 親和素-HRP 標(biāo)記物

室溫孵育0.5 小時

洗3 次

加100ul TMB，避光，顯色20 至30 分鐘

加100ul 硫酸，終止反應(yīng)

在450nm 處讀取吸光度

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注意: 請以原文說明書為準(zhǔn)

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