Nephrin 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

上海信帆專(zhuān)業(yè)提供各類(lèi)實(shí)驗(yàn)室代測(cè)服務(wù)，包含PCR實(shí)驗(yàn)代測(cè)，放免實(shí)驗(yàn)代測(cè)，免疫組化實(shí)驗(yàn)代測(cè)，免疫印跡實(shí)驗(yàn)代測(cè)等，歡迎大家！

Nephrin 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，zui后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。

一、 樣品RNA的抽提
 

1.  取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其*溶解。
 

2.  兩相分離 每1 ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2 ml的lv仿，蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12 000 rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚lv仿相，中間層以及無(wú)色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。
 

3.  RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無(wú)RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12 000 rpm 離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見(jiàn)的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。
 

4.  RNA清洗 移去上清液，每1 mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1 ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀?；靹蚝?，4℃下7 000 rpm離心5分鐘。
 

5.  RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
 

6.  溶解RNA沉淀 溶解RNA時(shí)，先加入無(wú)RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次，使其*溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。
 

二、 RNA質(zhì)量檢測(cè)
 

1.  紫外吸收法測(cè)定
 

先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋?zhuān)?:100）后，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，測(cè)定RNA溶液 濃度和純度。
 

 （1）濃度測(cè)定
 

A₂₆₀下讀值為1表示40 μg RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計(jì)算公式為：A₂₆₀ ×稀釋倍數(shù)× 40 μg/ml。具體計(jì)算如下：

RNA溶于40 μl DEPC水中，取5 μl，1:100稀釋至495 μl的TE中，測(cè)得A₂₆₀ = 0.21

RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl

取5 ul用來(lái)測(cè)量以后，剩余樣品RNA為35 μl，剩余RNA總量為：

35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg

（2）純度檢測(cè)
 

RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。
 

2.  變性瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定
 

（1）制膠
 

1 g瓊脂糖溶于72 ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。

10×MOPS電泳緩沖液

濃度  成分

0.4 M  MOPS，pH 7.0

0.1 M  乙酸鈉

0.01 M  EDTA
 

灌制凝膠板，預(yù)留加樣孔至少可以加入25 μl溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個(gè)毫米。

（2）準(zhǔn)備RNA樣品
 

取3 μgRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10 μg/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。

（3）電泳
 

上樣前凝膠須預(yù)電泳5 min，隨后將樣品加入上樣孔。5-6 V/cm電壓下2 h，電泳至溴酚蘭指示劑進(jìn)膠至少2-3 cm。
 

（4）紫外透射光下觀察并拍照
 

28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類(lèi)型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個(gè)更小稍微擴(kuò)散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過(guò)程中如果出現(xiàn)DNA污染，將會(huì)在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn)，即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。用數(shù)碼照相機(jī)拍下電泳結(jié)果。
 

三、樣品cDNA合成
 

1.  反應(yīng)體系
 

序號(hào)          反應(yīng)物           劑量

1          逆轉(zhuǎn)錄buffer       2 μl

2         上游引物              0.2 μl

3         下游引物              0.2 μl

4          dNTP                   0.1 μl

5       逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV     0.5 μl

6         DEPC水              5 μl

7          RNA模版            2 μl

8           總體積               10 μl
 

輕彈管底將溶液混合，6 000 rpm短暫離心。
 

2.  混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μl，37℃水浴60分鐘。
 

3.  取出后立即95℃干浴3分鐘，得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80℃待用。
 

四、 梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品的管家基因（β-actin）實(shí)時(shí)定量PCR（內(nèi)參由我司上海信帆生物提供）
 

1.  β-actin陽(yáng)性模板的標(biāo)準(zhǔn)梯度制備 陽(yáng)性模板的濃度為10¹¹，反應(yīng)前取3 μl按10倍稀釋?zhuān)铀?7 μl并充分混勻）為10¹⁰，依次稀釋至10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴，以備用。
 

2.  反應(yīng)體系如下：
 

標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系
 

序號(hào)           反應(yīng)物                           劑量

1       SYBR Green 1 染料             10 μl

2       陽(yáng)性模板上游引物F              0.5 μl

3      陽(yáng)性模板下游引物R              0.5 μl

4                 dNTP                            0.5 μl

5                 Taq酶                           1 μl

6           陽(yáng)性模板DNA                    5 μl

7              ddH₂O                            32.5 μl

8               總體積                            50 μl
 

輕彈管底將溶液混合，6 000 rpm短暫離心。
 

3.  管家基因反應(yīng)體系：
 

序號(hào)            反應(yīng)物                                劑量

1      SYBR Green 1 染料                   10 μl

2      內(nèi)參照上游引物F                         0.5 μl

3     內(nèi)參照下游引物R                         0.5 μl

4               dNTP                                    0.5 μl

5               Taq酶                                   1 μl

6      待測(cè)樣品cDNA                             5 μl

7              ddH₂O                                  32.5 μl

8             總體積                                    50 μl
 

輕彈管底將溶液混合， 6000 rpm短暫離心。
 

3.  制備好的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)樣本同時(shí)上機(jī)，反應(yīng)條件為：93℃　2分鐘，然后93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個(gè)循環(huán)。
 

五、 制備用于繪制梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線的DNA模板
 

1.  針對(duì)每一需要測(cè)量的基因，選擇一確定表達(dá)該基因的cDNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。
 

2.  反應(yīng)體系
 

序號(hào)                     反應(yīng)物                        劑量

1                     10× PCR緩沖液            2.5 ul

2                           MgCl2 溶液              1.5 ul

3                           上游引物F                 0.5 ul

4                           下游引物R                0.5 ul

5                            dNTP混合液            3 ul

6                            Taq聚合酶               1 ul

7                             cDNA                       1 ul

8                    加水至總體積為               25 ul
 

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
 

35個(gè)PCR循環(huán)（94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃1分鐘）； 72?C延伸5分鐘。
 

（3）PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。
 

（4）將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋: 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋: 設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1×10¹⁰，依次稀釋至10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴幾個(gè)濃度梯度。
 

六、 待測(cè)樣品的待測(cè)基因?qū)崟r(shí)定量PCR

1.  所有cDNA樣品分別配置實(shí)時(shí)定量 PCR反應(yīng)體系。

2.  體系配置如下：（信帆生物提供實(shí)驗(yàn)中所需的所有試劑，老師提供樣本即可）
 

序號(hào)             反應(yīng)物                                劑量

1            SYBR Green 1 染料               10 ul

2                上游引物                               1 ul

3                下游引物                               1 ul

4                  dNTP                                   1 ul

5              Taq聚合酶                               2 ul

6             待測(cè)樣品cDNA                        5 ul

7                   ddH2O                              30 ul

8                   總體積                               50 ul
 

輕彈管底將溶液混合，6 000 rpm短暫離心。
 

（3）將配制好的PCR反應(yīng)溶液置于Realtime PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：93℃ 2分鐘預(yù)變性，然后按93℃ 1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共40做個(gè)循環(huán)，zui后72℃7分鐘延伸。
 

七、 實(shí)時(shí)定量PCR使用引物列表
 

引物設(shè)計(jì)軟件：上海信帆生物提供免費(fèi)的引物設(shè)計(jì)與合成服務(wù)，并遵循以下原則：引物與模板的序列緊密互補(bǔ)；引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)；引物不在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)。
 

八、電泳
 

各樣品的目的基因和管家基因分別進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，GoldView染色，檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。