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產(chǎn)品簡(jiǎn)介

CAR/TCR基因拷貝數(shù)檢測(cè)試劑盒適用于定量檢測(cè)來源于HIV-1型慢病毒載體技術(shù)制備的人源細(xì)胞產(chǎn)品，如CAR-T或TCR-T細(xì)胞基因組中CAR或TCR基因的拷貝數(shù)。

CAR/TCR基因拷貝數(shù)檢測(cè)試劑盒基于熒光探針定量PCR原理，采用多重qPCR方法分別檢測(cè)轉(zhuǎn)移質(zhì)粒上與整合或表達(dá)功能相關(guān)的DNA序列和人體細(xì)胞中單拷貝基因(Single Copy Gene, SCG)的方法，計(jì)算得到樣本中平均每個(gè)細(xì)胞的目的基因拷貝數(shù)，如CAR或TCR基因拷貝數(shù)水平。其定量限可以達(dá)到101 copies/μL水平。該試劑盒需要與本公司的磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒(Cat#18461ES/18462ES)配套使用。

產(chǎn)品信息

組分信息

*IC：Internal control，內(nèi)部對(duì)照。

運(yùn)輸和儲(chǔ)存條件

1. 所有組分均干冰運(yùn)輸，-25~-15℃保存，有效期2年。且41313-A和41313-B均需避光保存。

2. 收到貨后，請(qǐng)檢查共5個(gè)組分是否齊全，并立即放入對(duì)應(yīng)的保存溫度中儲(chǔ)存。

適用機(jī)型

包含但不限于以下儀器：

Thermo Scientific：ABI 7500，ABI Quant Studio 5；

上海宏石醫(yī)療科技：SLAN-96S。

使用說明

1. CAR/TCR DNA定量參考品的稀釋和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

CAR/TCR DNA定量參考品是同時(shí)含有CAR/TCR目的基因序列和SCG目的基因序列的質(zhì)粒DNA，所以試劑盒的CAR/TCR DNA Control組分里，CAR/TCR和SCG的基因拷貝數(shù)是一樣的。

用試劑盒中的DNA Dilution Buffer（DNA稀釋液）將CAR/TCR DNA Control定量參考品進(jìn)行梯度稀釋*，稀釋濃度依次為2.1×106 copies/μL、2.1×105 copies/μL、2.1×104 copies/μL、2.1×103 copies/μL、2.1×102 copies/μL。操作如下：

1）將試劑盒中CAR/TCR DNA Control和DNA Dilution Buffer置于室溫融化，然后輕微振蕩混勻，低速離心10 sec。

2）取6支干凈的1.5 mL離心管，分別標(biāo)記為Std0、Std1、Std2、Std3、Std4、Std5。

3）在標(biāo)記Std0的1.5 mL管中加90 μL DNA Dilution Buffer和10 μL CAR/TCR DNA Control，即稀釋為2.1×107 copies/μL，振蕩混勻后短暫快速離心10 sec，該濃度可分裝置于-25~-15℃短期保存（不超過6個(gè)月）**，使用時(shí)避免反復(fù)凍融。

4）在Std1、Std2、Std3、Std4、Std5管中先分別加入90 μL DNA Dilution Buffer***，再進(jìn)行梯度稀釋****，稀釋方法如下：

表1 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋

*每個(gè)濃度做3個(gè)復(fù)孔，該試劑可測(cè)試2.1×106 copies/μL~2.1×102 copies/μL線性范圍。若需要，可適當(dāng)擴(kuò)大或縮小線性范圍。

**為減少反復(fù)凍融次數(shù)和避免污染，建議初次使用時(shí)將DNA定量參考品分裝儲(chǔ)存于-25~-15℃。

***已融化未使用的DNA Dilution Buffer可保存于2~8℃ 7天，若長(zhǎng)時(shí)間不用，請(qǐng)放置于-25~-15℃。

****為確保模板混勻，每個(gè)梯度稀釋時(shí)需輕微震蕩混勻約1 min。

2. 樣本加標(biāo)回收質(zhì)控ERC的制備

根據(jù)需要設(shè)置ERC中CAR/TCR DNA標(biāo)準(zhǔn)品濃度（以制備加2.1×104 copies CAR/TCR DNA量的ERC為例），具體操作：

1） 取100 μL待測(cè)樣本加入1.5 mL潔凈的離心管中，再加入10 μL Std4，混勻，標(biāo)記為ERC。

2） 加標(biāo)回收ERC和同批待測(cè)樣本一起進(jìn)行樣本前處理，制備加標(biāo)回收ERC純化液。

3. 陰性抽提質(zhì)控NCS的制備

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性抽提質(zhì)控NCS，具體操作如下：

1） 取100 μL樣本基質(zhì)溶液（或DNA Dilution Buffer）加入1.5 mL潔凈的離心管中，標(biāo)記為NCS。

2） 陰性質(zhì)控NCS和同批待測(cè)樣本一起進(jìn)行樣本前處理，制備成陰性質(zhì)控NCS純化液。

4. 無模板對(duì)照NTC的制備

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置無模板對(duì)照NTC，具體操作如下：

1） 無模板對(duì)照NTC無需進(jìn)行樣本前處理，在qPCR法檢測(cè)CAR/TCR DNA含量階段開始配置即可。

2） 每管或孔中的NTC反應(yīng)體系為20 μL Mix混合液（即15 μL CAR/TCR qPCR Mix + 4μL CAR/TCR Primer&Probe Mix+ 1μL IC）+ 10 μL DNA Dilution Buffer，建議配置3個(gè)重復(fù)孔的量。

5. 反應(yīng)體系

表2 標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系

*根據(jù)反應(yīng)孔數(shù)計(jì)算本次所需的Mix混合液總量：Mix混合液=（反應(yīng)孔數(shù)+2）×(15+4+1) μL（含有2孔的損失量）。通常，每個(gè)樣本做3個(gè)重復(fù)孔。

**反應(yīng)孔數(shù)=（5個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)曲線+1個(gè)無模板對(duì)照NTC+1個(gè)陰性抽提質(zhì)控NCS+待測(cè)樣TS個(gè)數(shù)+待測(cè)樣本對(duì)應(yīng)加標(biāo)回收ERC個(gè)數(shù)）×3。

NTC (No Template Control)：DNA Dilution Buffer

NCS (Negative Control Solution)：樣本基質(zhì)溶液或DNA Dilution Buffer進(jìn)行樣本前處理后，所得純化液為NCS

TS (Test Sample)：待測(cè)樣本

ERC (Extraction Recovery Control)：待測(cè)樣本中加入如2.1×104 copies標(biāo)準(zhǔn)品DNA后進(jìn)行樣本前處理，所得純化液為加標(biāo)回收ERC

***加樣完成密封好管子后，請(qǐng)低速離心10 sec將管壁的液體離心收集至管底，再震蕩混勻5 sec以上，混勻反應(yīng)液，再低速離心10 sec將管壁的液體離心收集至管底，如有氣泡，需將氣泡排盡。

下圖為參考板位：

表3 上機(jī)參考板位

該示例是對(duì)CAR/TCR基因拷貝數(shù)的qPCR法檢測(cè)操作的展示，檢測(cè)樣本包括：5個(gè)濃度梯度的CAR/TCR DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線、1個(gè)無模板對(duì)照NTC、1個(gè)陰性質(zhì)控NCS、3個(gè)待測(cè)樣本TS、3個(gè)樣本加標(biāo)回收ERC。建議每個(gè)樣本做3個(gè)重復(fù)孔。

6. 擴(kuò)增程序參數(shù)設(shè)置（兩步法）（以ABI公司7500 qPCR儀、軟件版本2.0為例）

1）創(chuàng)建空白新程序，選擇絕對(duì)定量檢測(cè)模板。

2）創(chuàng)建2個(gè)檢測(cè)探針，第一個(gè)命名為“CAR/TCR-DNA"，選擇報(bào)告熒光基團(tuán)為“FAM"，猝滅熒光基團(tuán)為“None"；第二個(gè)命名為“SCG，選擇報(bào)告熒光基團(tuán)為“VIC"，猝滅熒光基團(tuán)為“None"；再創(chuàng)建1個(gè)檢測(cè)探針，命名為“IC"，選擇報(bào)告熒光基團(tuán)為“CY5"，猝滅熒光基團(tuán)為“None"。參比熒光為ROX"（參比熒光可根據(jù)儀器型號(hào)等情況，選擇是否需要添加；若選擇ROX校準(zhǔn)，建議閾值線選擇0.06）。

3）在“Assign target (s) to the selected wells"面板中，將標(biāo)準(zhǔn)曲線孔的“Task"一欄設(shè)置為“Standard"，并且在“Quantity"一欄分別賦值為“2100000"、“210000"、“21000"、“2100"、“210"（含義為每孔的DNA濃度，單位為copies/μL），并且在相應(yīng)的“sample name"一欄中命名為“2100000 copies/μL"、“210000 copies/μL"、“21000 copies/μL"、“2100 copies/μL"、“210 copies/μL"；將無模板對(duì)照NTC孔的“Task"一欄設(shè)置為“NTC"；將陰性質(zhì)控NCS孔、待測(cè)樣本TS孔、樣本加標(biāo)回收ERC孔“Task"一欄設(shè)置為“Unknown"，并且在相應(yīng)的“Sample Name"一欄中分別命名為“NCS"、“TS"、“ERC"，之后點(diǎn)擊“Start Run"，開始儀器運(yùn)行。

4）擴(kuò)增程序設(shè)置：設(shè)置反應(yīng)體積30 μL。

表4 擴(kuò)增程序

7. qPCR 結(jié)果分析

1）在“Analysis"的“Amplification Plot"面板中，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)給出“Threshold"，有時(shí)系統(tǒng)給出的“Threshold"離基線太近，導(dǎo)致復(fù)孔之間Ct相差甚遠(yuǎn)，可手動(dòng)調(diào)節(jié)“Threshold"至合適位置，點(diǎn)擊“Analyze"。此時(shí)可在“Multicomponent Plot"初步查看擴(kuò)增曲線的形態(tài)是否正常。

2）在“Analysis"的“Standard Curve"面板中，可讀取標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2、擴(kuò)增效率(Eff%)、斜率(Slope)、截距(Intercept)等。正常的標(biāo)曲：R2>0.99，擴(kuò)增效率在90%≤Eff%≤110%范圍內(nèi)，Slope在-3.6~-3.1。

3）在“Analysis"的“View well table"面板中，“Quantity"一欄可讀取無模板對(duì)照NTC、陰性質(zhì)控NCS、待測(cè)樣本TS、樣本加標(biāo)回收ERC的檢測(cè)值，單位為copies/μL，后續(xù)可在檢測(cè)報(bào)告中進(jìn)行單位換算。

4）結(jié)果分析的參數(shù)設(shè)置需依據(jù)具體的機(jī)型及使用的軟件版本，一般也可由儀器自動(dòng)判讀。

5）根據(jù)待測(cè)樣本TS和樣本加標(biāo)回收ERC的檢測(cè)結(jié)果計(jì)算加標(biāo)回收率，加標(biāo)回收率要求在50%~150%之間。加標(biāo)回收率計(jì)算公式：回收率(%) = {樣本加標(biāo)測(cè)定值(eg.copies/µL)-樣本測(cè)定值(eg.copies/µL)} x洗脫體積(µL) / DNA加入量理論值(eg.copies) x 100%。

6）陰性質(zhì)控NCS的Ct值應(yīng)為Undetermined或Ct值≥35。

7）無模板對(duì)照NTC的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為Undetermined或Ct值≥38。

8）每個(gè)細(xì)胞中的CAR或TCR拷貝數(shù)=

注意事項(xiàng)

1. 使用本試劑前請(qǐng)仔細(xì)閱讀本說明書，實(shí)驗(yàn)應(yīng)規(guī)范操作，包括樣本處理、反應(yīng)體系的配制及加樣。

2. 每個(gè)組分在使用前都應(yīng)充分震蕩混勻，低速離心。

3. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

4. 本產(chǎn)品僅作科研用途。