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翌圣生物科技（上海）股份有限公司
初級(jí)會(huì)員·12年您現(xiàn)在的位置： 翌圣生物科技（上海）股份有限公司>>分子生物學(xué)>>核酸合成與提取>> 10922ES20Hieff Clone® Universal One Step Cloning Kit
10922ES20Hieff Clone® Universal One Step Cloning Kit
| 參考價(jià): | 面議 |
具體成交價(jià)以合同協(xié)議為準(zhǔn)- 10922ES20 產(chǎn)品型號(hào)
- Yeasen/翌圣生物 品牌
- 生產(chǎn)商 廠商性質(zhì)
- 上海市 所在地
訪問次數(shù)：778更新時(shí)間：2023-03-15 09:54:51
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- www.yeasen.com
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產(chǎn)品簡介
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 20T |
|---|---|---|---|
| 貨號(hào) | 10922ES20 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,化工,生物產(chǎn)業(yè) |
產(chǎn)品介紹
產(chǎn)品信息
產(chǎn)品名稱 | 貨號(hào) | 規(guī)格 | 價(jià)格（元） |
Hieff Clone® Universal One Step Cloning Kit | 10922ES20 | 20 T | 655.00 |
產(chǎn)品描述
Hieff Clone® Universal One Step Cloning Kit是新一代的同源重組克隆試劑盒，精心優(yōu)化的2×Hieff Clone® Universal Enzyme Premix預(yù)混了重組酶和重組反應(yīng)所需緩沖液，并添加了*的重組增強(qiáng)因子，可顯著提高重組克隆效率。
該試劑盒可以將PCR產(chǎn)物定向克隆至任何載體的任何位點(diǎn)，濃度可低至5 ng/μL，一次可實(shí)現(xiàn)多至6個(gè)片段的順序拼接克隆。將載體線性化，并在插入片段正、反向PCR引物5’端引入15-25 bp的線性化載體末端同源序列，使得插入片段PCR產(chǎn)物5’和3’末端分別帶有與線性化載體兩末端對(duì)應(yīng)的*一致的序列。PCR產(chǎn)物和線性化載體在重組酶的作用下，僅需50℃，5-15 min即可完成重組反應(yīng)。克隆陽性率可達(dá)95%以上。
產(chǎn)品組分
組分編號(hào) | 組分名稱 | 10922ES20 (20 T) |
10922-A | 2×Hieff Clone® Universal Enzyme Premix | 200 μL |
10922-B | 500 bp Control Insert (25 ng/μL) | 5 μL |
10922-C | pUC 19 Control Vector, linearized (50 ng/μL) | 5 μL |
產(chǎn)品應(yīng)用
快速克隆；定向克隆；定點(diǎn)突變。
運(yùn)輸與保存方式
冰袋運(yùn)輸。-20℃保存，有效期1年。
注意事項(xiàng)
1. 需自備的材料：
1）自備樣品：自備好線性化載體和插入片段。
2）自備試劑（僅羅列部分）：
① 超級(jí)感受態(tài)：轉(zhuǎn)化效率＞108 cfu/μg，如翌圣DH5α超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞（Cat#11802）；
② 高保真酶： 2×Hieff Canace® Gold PCR Master Mix（Cat#10149）或其他等效產(chǎn)品；
③ 菌落PCR mix：2×Hieff® Robust PCR Master Mix（With Dye)（Cat#10106）或其他等效產(chǎn)品；
④ 核酸染料：YeaRed Nucleic Acid Gel Stain (10,000 × in Water)（Cat#10202）或其他等效產(chǎn)品；
3）自備儀器耗材（僅羅列部分）：PCR儀，水平電泳槽，切膠儀，EP管等；
2. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。
3. 本產(chǎn)品僅作科研用途！
簡版操作步驟
一、重組反應(yīng)
1.線性化載體與插入片段使用量
Hieff Clone® 重組反應(yīng)體系最適片段及載體插入總體積為0.02-1 pmol，1-3片段為0.02-0.5 pmol，4-6片段為0.5-1 pmol。最適載體與插入片段摩爾比為1:3。對(duì)應(yīng)的DNA質(zhì)量可由以下公式計(jì)算獲得：
pmol = (插入片段使用量ng) × 1,000 / (插入堿基對(duì)數(shù) × 650 daltons)
50 ng 5000 bp的DNA段約為0.015 pmol
50 ng 500 bp的DNA段約為0.15 pmol
【注】：當(dāng)插入片段長度大于載體時(shí)，最適載體與插入片段使用量的計(jì)算方式應(yīng)互換，即插入片段當(dāng)做載體，載體當(dāng)做插入片段進(jìn)行計(jì)算。線性化載體及插入片段的使用量低可達(dá)到5 ng。線性化載體和插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物未純化，直接使用時(shí)，使用總體積應(yīng)不超過反應(yīng)體系體積的1/5，如20 μL體系不超過4 μL。
2.重組反應(yīng)體系（推薦冰上配制，各組分使用前需混勻）
組分 | 重組反應(yīng)1-3片段 | 重組反應(yīng)4-6片段 | 陰性對(duì)照 |
ddH2O | Up to 20 μL | Up to 20 μL | Up to 20 μL |
2×Hieff Clone® Universal Enzyme Premix | 10 μL | 10 μL | 0 μL |
片段總量 | 0.02-0.5 pmol | 0.5-1 pmol | X μL |
3.重組反應(yīng)條件
1）體系配制完成后，用移液器輕輕吸打混勻各組分，短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。
2）當(dāng)插入1個(gè)片段并且DNA總量＜300 ng時(shí)，建議反應(yīng)條件為50℃，5 min；當(dāng)插入片段數(shù)為2-4個(gè)時(shí)，建議反應(yīng)條件為50℃，15 min；當(dāng)插入片段數(shù)為5-6個(gè)時(shí)，建議反應(yīng)條件為50℃，30 min。
建議在PCR儀或水浴鍋等溫控精確的儀器上進(jìn)行反應(yīng)。
3）反應(yīng)產(chǎn)物可直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化，也可儲(chǔ)存于-20℃，待需要時(shí)解凍轉(zhuǎn)化。
二. 重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、涂板
1）在冰上解凍克隆感受態(tài)細(xì)胞（如：DH5α Chemically Competent Cell，Cat#11802）。
2）取10 μL冷卻重組產(chǎn)物，加入到100 μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈管壁數(shù)下混勻，在冰上放置25 min。
3）42℃熱激50 sec，冰浴孵育1-2 min。
4）加入750 μL SOC或LB培養(yǎng)基，37℃孵育2 min充分復(fù)蘇。37℃，200 rpm，搖菌60 min。
5）5000 rpm離心3 min，棄掉750 μL上清。用剩余培養(yǎng)基將菌體重懸，用無菌涂布棒在含有正確抗性的平板上輕輕涂勻。待菌液被吸收，將平板倒置，于37℃過夜培養(yǎng)。
樣本制備
單片段同源重組
一. 實(shí)驗(yàn)流程
圖1 Hieff Clone® 單片段同源重組實(shí)驗(yàn)流程圖
二. 制備線性化載體
選擇合適的克隆位點(diǎn)，并對(duì)載體進(jìn)行線性化。建議盡量選擇無重復(fù)序列且GC含量均勻的區(qū)域進(jìn)行克隆。載體克隆位點(diǎn)上下游25 bp區(qū)域內(nèi)GC含量均在40%-60%范圍內(nèi)最佳。線性化載體可通過限制性內(nèi)切酶酶切或反向PCR擴(kuò)增獲得。
1.酶切制備線性化載體
1）雙酶切線性化：線性化*，轉(zhuǎn)化背景低。建議使用。
2）單酶切線性化：線性化程度較差。可適當(dāng)延長酶切時(shí)間以降低轉(zhuǎn)化背景。
【注】：不含插入片段的假陽性克隆可能是由未線性化環(huán)狀載體轉(zhuǎn)化而形成的。若這種假陽性克隆比例較高，建議重新制備線性化載體。
2.反向PCR擴(kuò)增制備線性化載體
建議使用高保真聚合酶（如：2×Hieff Canace® Plus PCR Master Mix (With Dye) 高保真酶預(yù)混液，Cat#10154）進(jìn)行載體擴(kuò)增，以減少擴(kuò)增突變的引入。PCR擴(kuò)增模板應(yīng)盡量使用預(yù)線性化質(zhì)粒，以防止殘留環(huán)狀質(zhì)粒模板對(duì)克隆陽性率的影響。
Hieff Clone® 重組反應(yīng)體系兼容幾乎所有酶切反應(yīng)體系和常規(guī)PCR反應(yīng)體系，當(dāng)載體酶切產(chǎn)物或反向PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純度較高時(shí)，可以無需純化，直接進(jìn)行重組反應(yīng)。但純度較低且有可能含有未線性化環(huán)狀質(zhì)粒時(shí)，建議使用高質(zhì)量的試劑盒對(duì)線性化載體進(jìn)行膠回收純化，以提高產(chǎn)物純度并去除一部分未線性化的環(huán)狀載體，有利于提高重組效率。
三. PCR擴(kuò)增制備插入片段
1.設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物
Hieff Clone® 引物設(shè)計(jì)方式：通過在插入片段正、反向PCR引物的5’端引入15-25 bp（不包括酶切位點(diǎn)）的線性化載體末端同源序列，使得插入片段PCR產(chǎn)物5’和3’末端分別帶有與線性化載體兩末端對(duì)應(yīng)的*一致的序列。
插入片段正向擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方式：
5’—上游載體末端同源序列+酶切位點(diǎn)（可保留或刪除）+基因特異性正向擴(kuò)增引物序列—3’
插入片段反向擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方式：
3’—基因特異性反向擴(kuò)增引物序列+酶切位點(diǎn)（可保留或刪除）+下游載體末端同源序列—5’
【注】：①基因特異性正/反向擴(kuò)增序列即常規(guī)插入片段正/反向擴(kuò)增引物序列；
②上游/下游載體末端同源序列為線性化載體最末端序列（用于同源重組），GC含量40%-60%為佳。
推薦使用翌圣無縫克隆引物設(shè)計(jì)軟件（122.112.245.84:8080/hieff-clone/），自動(dòng)生成插入片段的擴(kuò)增引物。若手動(dòng)設(shè)計(jì)，可參照以下實(shí)例。
圖2 插入片段引物設(shè)計(jì)方案
【注】：最終引物長度超過40 bp，建議選用PAGE純化方式進(jìn)行引物合成。計(jì)算擴(kuò)增引物退火溫度時(shí)，只需計(jì)算基因特異性擴(kuò)增序列的Tm值，載體末端同源序列不應(yīng)參與計(jì)算，為了得到高效率克隆，建議Tm≥48℃。
2.插入片段PCR擴(kuò)增
插入片段擴(kuò)增可用任意PCR酶擴(kuò)增，無需考慮產(chǎn)物末端有無A尾 (重組過程中將被去除，在最終載體中不會(huì)出現(xiàn))。但為了減少擴(kuò)增突變的引入，建議使用高保真聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增（如：2×Hieff Canace® Plus PCR Master Mix (With Dye) 高保真酶預(yù)混液，Cat#10154）。
PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取少量產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以檢驗(yàn)擴(kuò)增產(chǎn)量和特異性。Hieff Clone®重組反應(yīng)體系兼容常規(guī)PCR反應(yīng)體系。因此，如果擴(kuò)增模板不是與載體抗性相同的環(huán)狀質(zhì)粒，且PCR產(chǎn)物電泳條帶單一，則擴(kuò)增產(chǎn)物可以無需純化，直接用于重組反應(yīng)。但PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純度較低時(shí)，建議使用高質(zhì)量的試劑盒對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化，以提高產(chǎn)物純度，有利于提高重組效率。
多片段同源重組
一. 實(shí)驗(yàn)流程
圖3 Hieff Clone® 多片段同源重組實(shí)驗(yàn)流程圖
二. 制備線性化載體
選擇合適的克隆位點(diǎn)，并對(duì)載體進(jìn)行線性化。建議盡量選擇無重復(fù)序列且GC含量均勻的區(qū)域進(jìn)行克隆。載體克隆位點(diǎn)上下游25 bp區(qū)域內(nèi)GC含量均在40%-60%范圍內(nèi)最佳。線性化載體可通過限制性內(nèi)切酶酶切或反向PCR擴(kuò)增獲得。
1.酶切制備線性化載體
1）雙酶切線性化：線性化*，轉(zhuǎn)化背景低。建議使用。
2）單酶切線性化：線性化程度較差。可適當(dāng)延長酶切時(shí)間以降低轉(zhuǎn)化背景。
【注】：不含插入片段的假陽性克隆可能是由未線性化環(huán)狀載體轉(zhuǎn)化而形成的。若這種假陽性克隆比例較高，建議重新制備線性化載體。
2.反向PCR擴(kuò)增制備線性化載體
建議使用高保真聚合酶（如：2×Hieff Canace® Plus PCR Master Mix (With Dye) 高保真酶預(yù)混液，Cat#10154）進(jìn)行載體擴(kuò)增，以減少擴(kuò)增突變的引入。PCR擴(kuò)增模板應(yīng)盡量使用預(yù)線性化質(zhì)粒，以防止殘留環(huán)狀質(zhì)粒模板對(duì)克隆陽性率的影響。
Hieff Clone® 重組反應(yīng)體系兼容幾乎所有酶切反應(yīng)體系和常規(guī)PCR反應(yīng)體系，當(dāng)載體酶切產(chǎn)物或反向PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純度較高時(shí)，可以無需純化，直接進(jìn)行重組反應(yīng)。但純度較低且有可能含有未線性化環(huán)狀質(zhì)粒時(shí)，建議使用高質(zhì)量的試劑盒對(duì)線性化載體進(jìn)行膠回收純化，以提高產(chǎn)物純度并去除一部分未線性化的環(huán)狀載體，有利于提高重組效率。
三. PCR擴(kuò)增制備插入片段
1.設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物
Hieff Clone® 引物設(shè)計(jì)方式：通過在插入片段正、反向PCR引物的5’端引入15-25 bp（不包括酶切位點(diǎn)）的線性化載體末端同源序列，使得插入片段PCR產(chǎn)物5’和3’末端分別帶有與線性化載體兩末端對(duì)應(yīng)的*一致的序列。
推薦使用翌圣無縫克隆引物設(shè)計(jì)軟件（//122.112.245.84:8080/hieff-clone/），自動(dòng)生成插入片段的擴(kuò)增引物。若手動(dòng)設(shè)計(jì)，可參照以下實(shí)例。以在pUC18載體的EcoR I 和Hind III 酶切位點(diǎn)間插入三段基因的引物設(shè)計(jì)為例，引物具體設(shè)計(jì)方案如下：
首先設(shè)計(jì)第一片段的正向擴(kuò)增引物和第三片段的反向擴(kuò)增引物(與載體相鄰的兩個(gè)插入片段)。
第一片段正向擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方式：
5’—上游載體末端同源序列+酶切位點(diǎn)（可保留或刪除）+第一片段基因特異性正向擴(kuò)增序列—3’
第三片段反向擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方式：
3’—第三片段基因特異性反向擴(kuò)增序列+酶切位點(diǎn)（可保留或刪除）+下游載體末端同源序列—5’
【注】：①基因特異性正/反向擴(kuò)增序列即常規(guī)插入片段正/反向擴(kuò)增引物序列；
②上游/下游載體末端同源序列為線性化載體最末端序列（用于同源重組），GC含量40%-60%為佳。
圖4 與載體相鄰的兩個(gè)插入片段引物設(shè)計(jì)方案
其次設(shè)計(jì)第一片段的反向擴(kuò)增引物和第二片段的正向擴(kuò)增引物。用于片段之間進(jìn)行重組的同源序列可以添加至前方片段的反向擴(kuò)增引物中，也可以添加至后方片段的正向擴(kuò)增引物中，還可以兩片段各添加一部分。以將同源序列添加至前方片段 （第一片段）的反向擴(kuò)增引物中為例，引物具體設(shè)計(jì)方案如圖5所示：
第一片段反向擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方式：
3’—第一片段基因特異性反向擴(kuò)增序列+第二片段5’端同源序列—5’
第二片段正向擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方式：
5’—第二片段基因特異性正向擴(kuò)增序列—3’
【注】：①基因特異性正/反向擴(kuò)增序列即常規(guī)插入片段正/反向擴(kuò)增引物序列；
②第二片段5’端同源序列即用于第一片段與第二片段進(jìn)行重組的添加序列。
最后設(shè)計(jì)第二片段的反向擴(kuò)增引物和第三片段的正向擴(kuò)增引物。設(shè)計(jì)方式與第一片段的反向擴(kuò)增引物和第二片段的正向擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方式一致。具體方案參見圖5。
圖5 第一片段的反向擴(kuò)增引物和第二片段的正向擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方案
【注】：最終引物長度超過40 bp，建議選用PAGE純化方式進(jìn)行引物合成。計(jì)算擴(kuò)增引物退火溫度時(shí)，只需計(jì)算基因特異性擴(kuò)增序列的Tm值，載體末端同源序列不應(yīng)參與計(jì)算，為了得到高效率克隆，建議Tm≥48℃。
2.插入片段PCR擴(kuò)增
插入片段擴(kuò)增可用任意PCR酶擴(kuò)增，無需考慮產(chǎn)物末端有無A尾 (重組過程中將被去除，在最終載體中不會(huì)出現(xiàn))。但為了減少擴(kuò)增突變的引入，建議使用高保真聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增（如：2×Hieff Canace® Plus PCR Master Mix (With Dye) 高保真酶預(yù)混液，Cat#10154）。
PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取少量產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以檢驗(yàn)擴(kuò)增產(chǎn)量和特異性。Hieff Clone®重組反應(yīng)體系兼容常規(guī)PCR反應(yīng)體系。因此，如果擴(kuò)增模板不是與載體抗性相同的環(huán)狀質(zhì)粒，且PCR產(chǎn)物電泳條帶單一，則擴(kuò)增產(chǎn)物可以無需純化，直接用于重組反應(yīng)。但PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純度較低時(shí)，建議使用高質(zhì)量的試劑盒對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化，以提高產(chǎn)物純度，有利于提高重組效率。
濃度測定
推薦使用瓊脂糖凝膠電泳比較條帶亮度的方法對(duì)DNA進(jìn)行定量。將線性化載體和插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物做數(shù)個(gè)等體積稀釋梯度，原始產(chǎn)物和稀釋后產(chǎn)物各取1 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DNA Marker）比較條帶亮度以確定其近似濃度（尤其針對(duì)于線性化載體和插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物未純化的情況）。也可通過核酸濃度測定儀對(duì)線性化載體和插入片段進(jìn)行測定，記錄濃度值（ng/μL）和OD260/OD280值后進(jìn)行投入量的計(jì)算。
重組反應(yīng)
1.線性化載體與插入片段使用量
Hieff Clone® 重組反應(yīng)體系最適片段及載體插入總體積為0.02-1 pmol，1-3片段為0.02-0.5 pmol，4-6片段為0.5-1 pmol。最適載體與插入片段摩爾比為1:3。對(duì)應(yīng)的DNA質(zhì)量可由以下公式計(jì)算獲得：
pmol = (插入片段使用量ng) × 1,000 / (插入堿基對(duì)數(shù) × 650 daltons)
50 ng 5000 bp的DNA段約為0.015 pmol
50 ng 500 bp的DNA段約為0.15 pmol
【注】：當(dāng)插入片段長度大于載體時(shí)，最適載體與插入片段使用量的計(jì)算方式應(yīng)互換，即插入片段當(dāng)做載體，載體當(dāng)做插入片段進(jìn)行計(jì)算。線性化載體及插入片段的使用量最可達(dá)到5 ng。線性化載體和插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物未純化，直接使用時(shí)，使用總體積應(yīng)不超過反應(yīng)體系體積的1/5，如20 μL體系不超過4 μL。
案例
以插入4片段（P1，P2，P3，P4）總濃度0.5 pmol為例：分別將長度為0.5 kb，1 kb，2 kb和3 kb的插入片段克隆至長度為5 kb的載體時(shí)，線性化載體的最適使用量應(yīng)為：0.025×5000 = 125 ng；插入片段P1最適使用量應(yīng)為：0.075×500=37.5 ng，插入片段P2最適使用量應(yīng)為：0.075×1000=75 ng，插入片段P3最適使用量應(yīng)為：0.075×2000=150 ng，插入片段P4最適使用量應(yīng)為：0.075×3000=225 ng。
2.重組反應(yīng)體系（推薦冰上配制，各組分使用前需混勻）
組分 | 重組反應(yīng)1-3片段 | 重組反應(yīng)4-6片段 | 陰性對(duì)照 |
ddH2O | Up to 20 μL | Up to 20 μL | Up to 20 μL |
2×Hieff Clone® Universal Enzyme Premix | 10 μL | 10 μL | 0 μL |
片段總量 | 0.02-0.5 pmol | 0.5-1 pmol | X μL |
3.重組反應(yīng)條件
1）體系配制完成后，用移液器輕輕吸打混勻各組分，短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。
2）當(dāng)插入1個(gè)片段并且DNA總量＜300 ng時(shí)，建議反應(yīng)條件為50℃，5 min；當(dāng)插入片段數(shù)為2-4個(gè)時(shí)，建議反應(yīng)條件為50℃，15 min；當(dāng)插入片段數(shù)為5-6個(gè)時(shí)，建議反應(yīng)條件為50℃，30 min。
建議在PCR儀或水浴鍋等溫控精確的儀器上進(jìn)行反應(yīng)。
3）反應(yīng)產(chǎn)物可直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化，也可儲(chǔ)存于-20℃，待需要時(shí)解凍轉(zhuǎn)化。
轉(zhuǎn)化涂板
1. 在冰上解凍克隆感受態(tài)細(xì)胞（如：DH5α Chemically Competent Cell，Cat#11802）。
2. 取10 μL冷卻重組產(chǎn)物，加入到100 μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈管壁數(shù)下混勻，在冰上放置25 min。
3. 42℃熱激50 sec，冰浴孵育1-2 min。
4. 加入750 μL SOC或LB培養(yǎng)基，37℃孵育2 min充分復(fù)蘇。37℃，200 rpm，搖菌60 min。
5. 5000 rpm離心3 min，棄掉750 μL上清。用剩余培養(yǎng)基將菌體重懸，用無菌涂布棒在含有正確抗性的平板上輕輕涂勻。待菌液被吸收，將平板倒置，于37℃過夜培養(yǎng)。
克隆鑒定
方便快捷的方法是菌落PCR。用無菌的槍頭或牙簽將單個(gè)菌落挑至20-50 μL LB培養(yǎng)基中混勻，直接取1 μL作為PCR模板。推薦至少用一條通用測序引物進(jìn)行菌落PCR，這樣可以避免PCR假陽性的產(chǎn)生。后續(xù)也可做酶切或測序鑒定。
常見問答
1、最佳克隆位點(diǎn)選擇？
答：在選擇克隆位點(diǎn)時(shí)，應(yīng)避免選擇克隆位點(diǎn)上下游50 bp內(nèi)有重復(fù)序列的區(qū)域。當(dāng)克隆位點(diǎn)上下游25 bp區(qū)域內(nèi)GC含量均在40%-60%范圍內(nèi)時(shí)，重組效率將達(dá)到最大。若高于70%或者低于30%，重組效率會(huì)受到較大影響。
2、無克隆長出或克隆數(shù)較少？
答：出現(xiàn)該情況，建議使用翌圣陽性對(duì)照（Cat#10923），可排除試劑盒本身的影響，并進(jìn)行進(jìn)一步判定，主要有以下可能情況：
1）引物設(shè)計(jì)不合適：推薦【同源序列（15-25 bp）+完整的酶切位點(diǎn)+基因特異性擴(kuò)增引物】，GC含量40% - 60%。
2）感受態(tài)細(xì)胞效率低：使用新鮮制備或妥善凍存的感受態(tài)細(xì)胞，確保其轉(zhuǎn)化效率>107 cfu/μg。每次操作時(shí)可設(shè)置一組轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，以檢測感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。連接產(chǎn)物體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的1/10，否則會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。
3）線性化載體和插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物的使用量不足/過量，或者比例不佳：盡量按照推薦的量和比例配制重組反應(yīng)體系。
4）線性化載體和插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物不純，抑制反應(yīng)：線性化載體和插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物未純化，直接使用時(shí)，使用總體積應(yīng)不超過反應(yīng)體系體積的1/5，如20 μL體系不超過4 μL。建議線性化載體、插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收純化，純化產(chǎn)物溶解在ddH2O中。
3、出現(xiàn)較多假陽性
答：主要有以下可能情況：
1）載體線性化不*：即使是痕量未*酶切的載體也會(huì)產(chǎn)生很高的轉(zhuǎn)化背景。可通過陰性對(duì)照檢測載體是否線性化*，優(yōu)化酶切體系，提高限制性內(nèi)切酶使用量、延長酶切反應(yīng)時(shí)間、膠回收純化酶切產(chǎn)物等都可以有效減少環(huán)狀質(zhì)粒殘留。
2）插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物混有非特異擴(kuò)增產(chǎn)物：建議：①優(yōu)化PCR體系，提高特異性；②膠回收PCR產(chǎn)物；③鑒定更多克隆。
3）反應(yīng)體系中混入了相同抗性的質(zhì)粒：PCR擴(kuò)增模板(載體或插入片段)為環(huán)狀質(zhì)粒時(shí)，若擴(kuò)增產(chǎn)物直接用于重組反應(yīng)，殘留環(huán)狀質(zhì)粒模板會(huì)產(chǎn)生較高的轉(zhuǎn)化背景。建議使用預(yù)線性化質(zhì)粒作為擴(kuò)增模板、擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DpnI消化或擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化。
4、菌落PCR無條帶
答：主要有以下可能情況：
1）引物不正確：推薦使用載體的通用引物或至少使用一條通用引物進(jìn)行菌落PCR檢測。
2）PCR體系或程序不合適：沒有目的條帶也沒有空質(zhì)粒條帶，建議優(yōu)化PCR體系、程序；或者提取質(zhì)粒，以質(zhì)粒做模板PCR驗(yàn)證；或者進(jìn)行酶切驗(yàn)證。
3）重組失敗：沒有目的條帶，只有空質(zhì)粒的條帶，說明重組不成功，載體線性化不*，建議優(yōu)化酶切體系。
HB220311
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