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翌圣生物科技(上海)股份有限公司

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13331ES16MaxUp II 雙模式mRNA建庫試劑盒
參考價: 面議
具體成交價以合同協(xié)議為準(zhǔn)
  • 13331ES16 產(chǎn)品型號
  • Yeasen/翌圣生物 品牌
  • 生產(chǎn)商 廠商性質(zhì)
  • 上海市 所在地

訪問次數(shù):852更新時間:2023-03-15 09:03:55

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產(chǎn)品簡介
供貨周期 現(xiàn)貨 應(yīng)用領(lǐng)域 生物產(chǎn)業(yè)
試劑盒包含兩個獨立模塊,BOX-I的核心為純化mRNA所需的oligo(dT)磁珠。BOX-II包含mRNA pian段化試劑,反轉(zhuǎn)錄試劑,常規(guī)和鏈特異性dscDNA合成,以及后續(xù)建庫所需的所有試劑。其中鏈特異性二鏈合成buffer中將dTTP替換為dUTP,使cDNA第二鏈中摻入dUTP,而本試劑盒使用的高保真DNA聚合酶無法擴增含尿嘧啶的DNA模板,實現(xiàn)鏈特異性。
產(chǎn)品介紹

Hieff NGS® MaxUp II Dual-mode mRNA Library Prep Kit for MGI®

 

MaxUp II 雙模式mRNA建庫試劑盒

 

產(chǎn)品信息

 

產(chǎn)品名稱

產(chǎn)品編號

規(guī)格

價格(元)

Hieff NGS® MaxUp II Dual-mode mRNA Library Prep Kit for MGI®

MaxUp II 雙模式mRNA 建庫試劑盒

13331ES16

16 T

4563.00

13331ES96

96 T

22563.00

 

產(chǎn)品描述

 

Hieff NGS® MaxUp II Dual-model mRNA Library Prep Kit for MGI®是針對MGI®高通量測序平臺專門研發(fā)的用于mRNA轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建試劑盒,本試劑盒cDNA二鏈合成Endprep、dA-tailing進行合并,極大地縮減建庫時間。二鏈合成模塊配有兩種buffer,客戶可根據(jù)需要進行常規(guī)建庫或鏈特異性建庫。本產(chǎn)品適用于起始模板為0.1-4μg不同來源真核生物總RNA樣本。經(jīng)過mRNA分離、片段化、雙鏈cDNA合成、末端修復(fù)、加A尾、接頭連接和文庫擴增,總RNA樣品終轉(zhuǎn)化為適用于MGI®平臺測序的文庫。

試劑盒包含個獨立模塊,BOX-I的核心為純化mRNA所需的oligo(dT)磁珠。BOX-II包含mRNA  pian段化試劑,反轉(zhuǎn)錄試劑,常規(guī)和鏈特異性dscDNA合成,以及后續(xù)建庫所需的所有試劑。其中鏈特異性二鏈合成buffer中將dTTP替換為dUTP,使cDNA第二鏈中摻入dUTP,而本試劑盒使用的高保真DNA聚合酶無法擴增含尿嘧啶的DNA模板,實現(xiàn)鏈特異性。提供的所有試劑都經(jīng)過嚴格的質(zhì)量控制和功能驗證,zui大程度上保證了文庫構(gòu)建的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

 

產(chǎn)品組分

 

運輸與保存方法

 

冰袋運輸。效期一年。存儲溫度如下,切不可搞錯!

Box I:2-8℃保存;Box II:-20℃保存

 

注意事項

 

一、關(guān)于操作

1.為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。

2.請于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻,短暫離心后置于冰上待用。

3.推薦在帶熱蓋的PCR儀中進行各步驟反應(yīng),使用前應(yīng)預(yù)熱PCR儀至反應(yīng)溫度附近。

4.請使用無RNase污染的耗材,并對實驗區(qū)域定期進行清理,推薦使用ThermoFisher公司的RNAZapTM高效核酸去除噴霧去除RNA酶污染。

5.PCR產(chǎn)物因操作不當(dāng)極容易產(chǎn)生氣溶膠污染,進而影響實驗結(jié)果準(zhǔn)確性。推薦將PCR反應(yīng)體系配制區(qū)和PCR產(chǎn)物純化檢測區(qū)進行強制性的物理隔離;配備文庫構(gòu)建移液器等設(shè)備;定時對各實驗區(qū)域進行清潔(推薦使用ThermoFisher公司的DNAZapTM高效核酸去除噴霧),以保證實驗環(huán)境的潔凈度。

二、應(yīng)用范圍

本試劑盒適用于起始模板量為0.1-4 μg(體積≤50 μL)的高質(zhì)量動物、植物和真菌等真核生物的總RNA。如初始RNA濃度偏低,體積超過50 μL,可使用Hieff NGS® RNA Cleaner磁珠進行濃縮。RNA需通過Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico芯片檢測,RIN值要求>7,以保證mRNA有完整的poly(A)尾結(jié)構(gòu)。

本試劑盒的mRNA分離模塊使用的是oligo (dT)磁珠,只有帶poly(A)尾的mRNA才能被提取;其他不具poly(A)尾的RNA,如非編碼RNA、無poly(A)尾的mRNA等不能適用本試劑盒。此外,F(xiàn)FPE樣本中的mRNA降解嚴重,通常無完整的poly(A)尾結(jié)構(gòu),故亦無法使用本試劑盒進行建庫。

本試劑盒所制備文庫可進行多種RNA-Seq應(yīng)用,包括:

基因表達(gene expression)

單核苷酸變異檢測(single nucleotide variation discovery)

基因融合鑒定(gene fusion identification)

剪切變異體分析(splice variant analysis)

三、關(guān)于接頭連接(Adapter Ligation)

1. 目前華大智造有2種序號的接頭:1-128和501-596。關(guān)于其使用要求,請詳見華大智造“關(guān)于Adapter使用”有關(guān)說明或咨詢本公司。此外,華大智造申明:2種接頭由于設(shè)計工藝不同,禁止混用,否則測序數(shù)據(jù)無法拆分!

2. 我們建議選用高質(zhì)量的商業(yè)化接頭,如客戶使用自制接頭,請委托具有NGS引物合成經(jīng)驗的公司,并備注需進行嚴格的防污染控制。此外,進行接頭退火操作時,請在超凈臺完成。每次只操作一種接頭,防止交叉污染。

3. 建庫過程中,接頭濃度過高或過低都會導(dǎo)致建庫成功率變低。本試劑盒操作方案中,所加入的接頭體積固定為5 μL,請根據(jù)初始的RNA投入量,參考表1對接頭進行稀釋。接頭稀釋液請選擇0.1×TE buffer,稀釋過的接頭可在4°C保存48小時。

 

表1  Input Total RNA量與接頭濃度推薦表

Input Total RNA

Adapter stock concentration

100–499 ng

2 μM

500–4000 ng

5 μM

四、關(guān)于磁珠純化與分選(Bead-based Clean Up and Size Selection)

1. 建庫過程中有多個步驟需要使用DNA純化磁珠,我們推薦使用Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)進行DNA純化和分選。

2. 磁珠使用前應(yīng)先平衡至室溫,否則會導(dǎo)致得率下降、分選效果不佳。

3. 磁珠每次使用前都應(yīng)充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。

4. 轉(zhuǎn)移上清時,請勿吸取磁珠,即使微量殘留都將影響后續(xù)文庫質(zhì)量。

5. 磁珠洗滌使用的80%乙醇應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配,否則將影響回收效率。

6. 產(chǎn)物洗脫前應(yīng)將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇殘留影響后續(xù)反應(yīng);過分干燥又會導(dǎo)致磁珠開裂進而降低純化得率。通常情況下,室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥。

7. DNA純化或長度分選產(chǎn)物如需保存,可使用0.1×TE Buffer洗脫,產(chǎn)物于4°C可保存2天,-20°C可保存1個月。

五、關(guān)于文庫擴增(Library Amplification)

1. 本試劑盒中的文庫擴增組分由本公司第二代高保真DNA聚合酶所組成,在第—代的基礎(chǔ)上,大大增強了擴增的均一性,即使是低拷貝的基因,也能進行無偏好性地擴增。

2. 文庫擴增步驟需要嚴格控制擴增循環(huán)數(shù)。循環(huán)數(shù)不足,將導(dǎo)致文庫產(chǎn)量低;循環(huán)數(shù)過多,又將導(dǎo)致文庫偏好性增加、重復(fù)度增加、嵌合產(chǎn)物增加、擴增突變積累等多種不良后果。表2列舉了使用本試劑盒進行文庫擴增,Input Total RNA量與相應(yīng)擴增循環(huán)數(shù)的推薦。

 

表2  Input Total RNA量與擴增循環(huán)數(shù)推薦表*

Input Total RNA

Number of cycles

Non-stranded

Stranded

100 ng

12-14

14-16

1000 ng

10-12

12-14

≥2000 ng

8-10

10-12

【注】:*由于不同物種和組織所提取的Total RNA中,mRNA的含量差異較大實驗中需根據(jù)建庫起始量、物種類型及樣本處理情況適當(dāng)調(diào)整擴增循環(huán)數(shù)。

六、關(guān)于文庫質(zhì)檢(Library Quality Analysis)

1. 通常情況下,構(gòu)建好的文庫可通過長度分布檢測和濃度檢測來進行質(zhì)量評價。

2. 文庫濃度檢測可使用:基于雙鏈DNA熒光染料的方法,如Qubit®、PicoGreen®等;基于qPCR定量的方法。

3. 推薦使用qPCR方法進行文庫濃度檢測:Qubit®等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測定方法,無法有效區(qū)分單端連接Adapter的產(chǎn)物、兩端均未連接Adapter的產(chǎn)物及其他不完整雙鏈結(jié)構(gòu)產(chǎn)物;qPCR定量基于PCR擴增原理,僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫(即可測序的文庫),可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測序文庫的干擾。

4. 文庫濃度檢測不可使用:基于光譜檢測的方法,如NanoDrop®等。

5. 文庫長度分布檢測,可通過Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細管電泳或微控流原理的設(shè)備進行檢測。

 

使用方法

 

一、自備材料

1. 純化磁珠:Hieff NGS® DNA Selection Beads(Cat#12601)或AMPure XP Beads(Cat#A63880)或其他等效產(chǎn)品。

2. RNA質(zhì)控:Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico Chip或其他等效產(chǎn)品。

3. Adapters:詳情請咨詢?nèi)A大智造或本公司。

4. 文庫質(zhì)檢:Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效產(chǎn)品;文庫定量試劑。

5. 其他材料:無水乙醇、無菌超純水、低吸附槍頭、PCR管、磁力架、PCR儀等。

二、操作流程

 

圖1 mRNA建庫試劑盒操作流程

三、操作步驟

3.1 mRNA純化和片段化(mRNA Purification and Fragmentation)

1. 將mRNA Capture Beads從2-8℃取出,靜置使其溫度平衡至室溫,約30 min。

2. 準(zhǔn)備一個Nuclease free離心管,0.1-4 μg總RNA,用Nuclease free水將體積補至50 μL,冰上放置備用。

3. 顛倒或旋渦振蕩混勻磁珠,吸取50 μL磁珠懸液加入至50 μL總RNA樣品中,用移液器吹打6次,使其充分混勻。

4. 將磁珠與RNA的混合物置于PCR儀中,65℃,5 min;4℃,hold,使得RNA變性。

5. 室溫孵育5 min,使mRNA與磁珠*結(jié)合。

6. 將樣品置于磁力架中,室溫靜置5 min,使mRNA與總RNA分離,小心移除上清。

7. 將樣品從磁力架上取出,用200 μL Beads Wash Buffer重懸磁珠,移液器反復(fù)吹打6次以*混勻。將樣品置于磁力架中,室溫靜置5 min,小心移除上清。

8. 重復(fù)步驟7,共洗滌兩次。

9. 將樣品從磁力架上取出,加入50 μL Tris Buffer重懸磁珠,用移液器反復(fù)吹打6次以*混勻。

10. 將樣品置于PCR儀中,80℃,2 min;25℃,hold,將mRNA洗脫下來。

11. 將樣品從PCR儀中取出,加入50 μL Beads Binding Buffer,用移液器反復(fù)吹打6次以*混勻。

12. 室溫放置5 min,使mRNA結(jié)合到磁珠上。

13. 將樣品置于磁力架中,室溫靜置5 min,小心移除上清。

14. 將樣品從磁力架上取出,用200 μL Beads Wash Buffer重懸磁珠,移液器反復(fù)吹打6次以*混勻,將樣品重新放回至磁力架中,室溫靜置5 min,吸掉全部上清。

【注】:后需要用10 μL移液器吸干凈殘留液體。

15.將樣品從磁力架上取出,用18.5 μL Frag/Prime buffer重懸磁珠,用移液器吹打6次以*混勻;將樣品置于PCR儀中(預(yù)設(shè)為94℃或85℃),可參考表3選擇片段化程序,但不同物種片段化的效果有差異,客戶可先根據(jù)自己的情況,做個片段化時間的梯度,比如94℃,5 min或85℃,6 min。使用Agilent 2100分析雙鏈cDNA純化產(chǎn)物大小

 

表3  mRNA  pian段化程序選擇

插入片段大小(bp)

打斷程序

150-200

94°C,6 min;

200-300

94°C5 min;

250-450

85°C8 min;

400-550

85°C6 min;

16. 片段化程序結(jié)束后,為防止poly(A)尾RNA與磁珠結(jié)合,請立即將樣品置于磁力架中,待溶液澄清后,轉(zhuǎn)移17 μL上清至一個新的nuclease free離心管中,立刻進入第—鏈合成反應(yīng)。

3.2 第—鏈cDNA的合成:

1. 將第—鏈合成試劑從-20°C取出,顛倒混勻后瞬離。按表4所示,配制第—鏈cDNA合成的反應(yīng)液。

 

4  第—鏈cDNA合成反應(yīng)體系

名稱

體積(μL)

Fragmented mRNA

17

Strand Specificity Reagent

6

1st Strand Enzyme Mix

2

2. 使用移液器輕輕吹打混勻,瞬離將反應(yīng)液離心至管底。

3. 將上述PCR管置于PCR儀中,按照表5所示設(shè)置反應(yīng)程序,進行第—鏈cDNA的合成。反應(yīng)結(jié)束后立即進行第二鏈cDNA的合成。

 

5  第—鏈cDNA合成反應(yīng)程序

溫度

時間

熱蓋 105°C

On

25°C

10 min

42°C

15 min

70°C

15 min

4°C

Hold

3.3第二鏈cDNA的合成/末端修復(fù)/加A

1. 將第二鏈合成試劑從-20 °C取出,解凍后顛倒混勻;按照表6所示,配制第二鏈cDNA合成/末端修復(fù)/加A反應(yīng)液。

 

表6 第二鏈cDNA合成反應(yīng)體系

名稱

體積(μL)

1st Strand cDNA

25 μL

2nd Strand Buffer ( dNTP or dUTP)*

30 μL

2nd Strand Enzyme Master Mix

5 μL

【注】:*如構(gòu)建普通mRNA文庫,請使用含dNTP的buffer;如構(gòu)建鏈特異性mRNA文庫,請使用含dUTP的buffer。

2. 使用移液器輕輕吹打混勻,瞬離將反應(yīng)液離心至管底。

3. 將上述PCR管置于PCR儀中,按照表7所示設(shè)置反應(yīng)程序,進行第二鏈cDNA的合成。

 

7  第二鏈cDNA合成反應(yīng)程序

溫度

時間

熱蓋 105°C

on

16°C

30 min

72°C

15 min

4°C

Hold

3.4 接頭連接(Adapter Ligation)

該步驟可在末端修復(fù)和dA尾添加的產(chǎn)物末端,連接特定的MGI®接頭。

1. 參考注意事項三中的表1,根據(jù)Input RNA量,稀釋Adapter至合適濃度。

2. 將表8中各試劑解凍后顛倒混勻,置于冰上備用。

3. 于3.3步驟結(jié)束后的PCR管中繼續(xù)配制表8所示反應(yīng)體系。

 

8  Adapter Ligation體系

名稱

體積(μL)

dA-tailed DNA

60

Ligation Enhancer

30*

Fast T4 DNA Ligase

5

DNA Adapter

5**

【注】:*Ligation Enhancer使用前請上下顛倒、振蕩,充分混勻并瞬時離心后使用。

**請根據(jù)注意事項三中表1的提示,用0.1×TE buffer對接頭進行稀釋,接頭體積固定為5 μL。

4. 使用移液器輕輕吹打混勻,并短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。

5. 將PCR管置于PCR儀中,設(shè)置表9所示反應(yīng)程序,進行接頭連接反應(yīng):

 

9  Adapter Ligation反應(yīng)程序

溫度

時間

熱蓋

Off

20°C

15 min

4°C

Hold

【注】:當(dāng)Input DNA量較低時,可嘗試將連接時間延長一倍,這將提高連接效率。

3.5 連接產(chǎn)物純化和片段大小分選(Post Ligation Clean Up and Size Selection)

目前有兩個方案應(yīng)用于該步驟,當(dāng)插入片段<200 bp時,使用方案A;當(dāng)插入片段≥200 bp時,使用方案B。

方案A:適用于插入片段150-200 bp的文庫(mRNA打斷方案為94°C,6 min)

1. 準(zhǔn)備工作:將Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取60 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.6×,Beads:DNA=0.6:1)至Adapter Ligation產(chǎn)物中,渦旋或吹打混勻,室溫孵育5 min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體,待溶液澄清后(約5 min),小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中,加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠,室溫孵育30 sec后,小心移除上清。

6. 重復(fù)步驟5,總計漂洗兩次。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中,開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂(不超過5 min)。

8. 將PCR管從磁力架中取出,加入102 μL ddH2O,渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻,室溫靜置5 min。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置,待溶液澄清后(約5 min),小心移取100 μL上清至新PCR管中,準(zhǔn)備進行第二輪純化。

9.  吸取80 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.8×,Beads:DNA=0.8:1)至Adapter Ligation產(chǎn)物中,渦旋或吹打混勻,室溫孵育5 min。

10. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體,待溶液澄清后(約5 min),小心移除上清。

11. 保持PCR管始終置于磁力架中,加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠,室溫孵育30 sec后,小心移除上清。

12. 重復(fù)步驟5,總計漂洗兩次。

13. 保持PCR管始終置于磁力架中,開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂(不超過5 min)。

14. 將PCR管從磁力架中取出,加入21 μL ddH2O,渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻,室溫靜置5 min。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置,待溶液澄清后(約5 min),小心移取20 μL上清至新PCR管中,進行PCR擴增。

方案B:適用于插入片段大于200 bp的文庫(mRNA打斷方案為94°C,5 min或85℃,8 min

方案B-1:接頭連接產(chǎn)物的純化

1. 準(zhǔn)備工作:將Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取80 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.8×,Beads:DNA=0.8:1)至Adapter Ligation產(chǎn)物中,渦旋或吹打混勻,室溫孵育5 min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體,待溶液澄清后(約5 min),小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中,加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠,室溫孵育30 sec后,小心移除上清。

6. 重復(fù)步驟5,總計漂洗兩次。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中,開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂(不超過5 min)。

8. 將PCR管從磁力架中取出,加入102 μL ddH2O,渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻,室溫靜置5 min。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置,待溶液澄清后(約5 min),小心移取100 μL上清至新PCR管中,準(zhǔn)備進行雙輪分選。

【注】:Ligation Enhancer中含有的高濃度PEG會對磁珠雙輪分選產(chǎn)生影響,所以必須經(jīng)過一輪純化后再進行雙輪分選。

方案B-2:雙輪分選

1. 請渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證混勻。

2. 根據(jù)DNA   pian段長度要求,參考表10,在上述100 μL DNA中加入第—輪分選磁珠,渦旋或移液器吹打10次混勻。

 

10  文庫分選推薦磁珠比例

DNA文庫插入片段大?。ǚ逯担琤p)

~ 200

~ 300

~ 400

~ 500

打斷條件

94℃,5 min

85℃,8 min

85℃,8 min

85℃,6 min

  接頭連接之后分選或文庫擴增之后分選

第—輪體積比

0.78×

0.68×

0.58×

0.4

第二輪體積比

0.20×

0.20×

0.20×

0.20×

【注】:此表推薦的雙輪分選比例適用于AMPure® XP磁珠和Hieff NGS® DNA Selection Beads;表中“×”表示樣品DNA體積。如所需文庫插入片段主峰為200 bp時,若在接頭連接之后分選,樣品DNA體積為100 μL,則第—輪分選磁珠使用體積為0.78×100 μL=78 μL,第二輪分選磁珠使用體積為0.20×100 μL=20 μL。

3. 室溫孵育5 min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中,待溶液澄清后(約5 min),小心轉(zhuǎn)移上清到干凈的離心管中,殘留1-2 μL溶液于管底。

5. 參考表10向上清中加入第二輪分選磁珠。

6. 渦旋混勻或移液器吹打10次混勻,室溫靜置5 min。

7. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中,待溶液澄清后(約5 min),小心移除上清。

8. 保持PCR管始終處于磁力架中,加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠,室溫孵育30 sec,小心移除上清。

9. 重復(fù)步驟8。

10. 保持PCR管始終處于磁力架中,開蓋干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂(約5 min)。

11. 將PCR管從磁力架中取出,加入21 μL ddH2O,渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻,室溫靜置5 min。

12. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后(約5 min),小心轉(zhuǎn)移20 μL上清至干凈管中。

3.6文庫擴增(Library Amplification)

該步驟將對純化或長度分選后的接頭連接產(chǎn)物進行PCR擴增富集。

1. 將表11中的試劑解凍后顛倒混勻,置于冰上備用。

2. 于無菌PCR管中配制表11所示反應(yīng)體系。

 

11  接頭連接產(chǎn)物PCR反應(yīng)體系

組分名稱

體積(μL)

Ultima HF Amplification Mix

25

Primer Mix for MGI®

5

Adapter Ligated DNA

20

3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻,并短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。

4. 將PCR管置于PCR儀中,設(shè)置表12示反應(yīng)程序,進行PCR擴增

 

表12  PCR擴增反應(yīng)程序

溫度

時間

循環(huán)數(shù)

98°C

1 min

1

98°C

10 sec

參照表2(注意事項五)

60°C

30 sec

72°C

30 sec

72°C

5 min

1

4°C

Hold

-

3.7 擴增產(chǎn)物磁珠純化或分選(Post Amplification Clean Up/Size Selection)

同3.5步驟中純化操作步驟。使用Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.9×,Beads:DNA=0.9:1)純化文庫擴增產(chǎn)物。

3.8 文庫質(zhì)量控制

通常情況下,構(gòu)建好的文庫可通過濃度檢測和長度分布檢測來進行質(zhì)量評價,具體請參見注意事項六。

3.9 文庫環(huán)化

使用Hieff NGS® Fast-Pace DNA Cyclization Kit for MGI®Cat#13341)或其他等效產(chǎn)品進行文庫單鏈環(huán)化反應(yīng)。

附錄一:mRNA  pian段化

 

圖2. mRNA不同打斷時間對應(yīng)雙鏈cDNA   pian段范圍。取1 μg Universal Human Reference RNA,經(jīng)mRNA提取試劑盒提取后,分別以94°C,6 min、85℃,8 min和85℃,5 min處理。打斷后mRNA進行雙連cDNA的合成,經(jīng)過1.8×磁珠回收后,通過Agilent 2100 Bioanalyzer進行檢測。

【注】:本結(jié)果使用的RNA是Agilent公司的Universal Human Reference RNA,若使用其他來源的RNA,優(yōu)化打斷時間。

 



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