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- 13331ES16 產(chǎn)品型號
- Yeasen/翌圣生物 品牌
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Hieff NGS® MaxUp II Dual-mode mRNA Library Prep Kit for MGI®
MaxUp II 雙模式mRNA建庫試劑盒
產(chǎn)品信息
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品編號 | 規(guī)格 | 價格(元) |
Hieff NGS® MaxUp II Dual-mode mRNA Library Prep Kit for MGI® MaxUp II 雙模式mRNA 建庫試劑盒 | 13331ES16 | 16 T | 4563.00 |
13331ES96 | 96 T | 22563.00 |
產(chǎn)品描述
Hieff NGS® MaxUp II Dual-model mRNA Library Prep Kit for MGI®是針對MGI®高通量測序平臺專門研發(fā)的用于mRNA轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建試劑盒,本試劑盒將cDNA二鏈合成與Endprep、dA-tailing進行合并,極大地縮減建庫時間。二鏈合成模塊配有兩種buffer,客戶可根據(jù)需要進行常規(guī)建庫或鏈特異性建庫。本產(chǎn)品適用于起始模板為0.1-4μg不同來源真核生物總RNA樣本。經(jīng)過mRNA分離、片段化、雙鏈cDNA合成、末端修復(fù)、加A尾、接頭連接和文庫擴增,總RNA樣品終轉(zhuǎn)化為適用于MGI®平臺測序的文庫。
試劑盒包含兩個獨立模塊,BOX-I的核心為純化mRNA所需的oligo(dT)磁珠。BOX-II包含mRNA pian段化試劑,反轉(zhuǎn)錄試劑,常規(guī)和鏈特異性dscDNA合成,以及后續(xù)建庫所需的所有試劑。其中鏈特異性二鏈合成buffer中將dTTP替換為dUTP,使cDNA第二鏈中摻入dUTP,而本試劑盒使用的高保真DNA聚合酶無法擴增含尿嘧啶的DNA模板,實現(xiàn)鏈特異性。提供的所有試劑都經(jīng)過嚴格的質(zhì)量控制和功能驗證,zui大程度上保證了文庫構(gòu)建的穩(wěn)定性和重復(fù)性。
產(chǎn)品組分
運輸與保存方法
冰袋運輸。效期一年。存儲溫度如下,切不可搞錯!
Box I:2-8℃保存;Box II:-20℃保存。
注意事項
一、關(guān)于操作
1.為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。
2.請于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻,短暫離心后置于冰上待用。
3.推薦在帶熱蓋的PCR儀中進行各步驟反應(yīng),使用前應(yīng)預(yù)熱PCR儀至反應(yīng)溫度附近。
4.請使用無RNase污染的耗材,并對實驗區(qū)域定期進行清理,推薦使用ThermoFisher公司的RNAZapTM高效核酸去除噴霧去除RNA酶污染。
5.PCR產(chǎn)物因操作不當(dāng)極容易產(chǎn)生氣溶膠污染,進而影響實驗結(jié)果準(zhǔn)確性。推薦將PCR反應(yīng)體系配制區(qū)和PCR產(chǎn)物純化檢測區(qū)進行強制性的物理隔離;配備文庫構(gòu)建移液器等設(shè)備;定時對各實驗區(qū)域進行清潔(推薦使用ThermoFisher公司的DNAZapTM高效核酸去除噴霧),以保證實驗環(huán)境的潔凈度。
二、應(yīng)用范圍
本試劑盒適用于起始模板量為0.1-4 μg(體積≤50 μL)的高質(zhì)量動物、植物和真菌等真核生物的總RNA。如初始RNA濃度偏低,體積超過50 μL,可使用Hieff NGS® RNA Cleaner磁珠進行濃縮。RNA需通過Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico芯片檢測,RIN值要求>7,以保證mRNA有完整的poly(A)尾結(jié)構(gòu)。
本試劑盒的mRNA分離模塊使用的是oligo (dT)磁珠,只有帶poly(A)尾的mRNA才能被提取;其他不具poly(A)尾的RNA,如非編碼RNA、無poly(A)尾的mRNA等不能適用本試劑盒。此外,F(xiàn)FPE樣本中的mRNA降解嚴重,通常無完整的poly(A)尾結(jié)構(gòu),故亦無法使用本試劑盒進行建庫。
本試劑盒所制備文庫可進行多種RNA-Seq應(yīng)用,包括:
基因表達(gene expression)
單核苷酸變異檢測(single nucleotide variation discovery)
基因融合鑒定(gene fusion identification)
剪切變異體分析(splice variant analysis)
三、關(guān)于接頭連接(Adapter Ligation)
1. 目前華大智造有2種序號的接頭:1-128和501-596。關(guān)于其使用要求,請詳見華大智造“關(guān)于Adapter使用”有關(guān)說明或咨詢本公司。此外,華大智造申明:2種接頭由于設(shè)計工藝不同,禁止混用,否則測序數(shù)據(jù)無法拆分!
2. 我們建議選用高質(zhì)量的商業(yè)化接頭,如客戶使用自制接頭,請委托具有NGS引物合成經(jīng)驗的公司,并備注需進行嚴格的防污染控制。此外,進行接頭退火操作時,請在超凈臺完成。每次只操作一種接頭,防止交叉污染。
3. 建庫過程中,接頭濃度過高或過低都會導(dǎo)致建庫成功率變低。本試劑盒操作方案中,所加入的接頭體積固定為5 μL,請根據(jù)初始的RNA投入量,參考表1對接頭進行稀釋。接頭稀釋液請選擇0.1×TE buffer,稀釋過的接頭可在4°C保存48小時。
表1 Input Total RNA量與接頭濃度推薦表
Input Total RNA | Adapter stock concentration |
100–499 ng | 2 μM |
500–4000 ng | 5 μM |
四、關(guān)于磁珠純化與分選(Bead-based Clean Up and Size Selection)
1. 建庫過程中有多個步驟需要使用DNA純化磁珠,我們推薦使用Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)進行DNA純化和分選。
2. 磁珠使用前應(yīng)先平衡至室溫,否則會導(dǎo)致得率下降、分選效果不佳。
3. 磁珠每次使用前都應(yīng)充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。
4. 轉(zhuǎn)移上清時,請勿吸取磁珠,即使微量殘留都將影響后續(xù)文庫質(zhì)量。
5. 磁珠洗滌使用的80%乙醇應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配,否則將影響回收效率。
6. 產(chǎn)物洗脫前應(yīng)將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇殘留影響后續(xù)反應(yīng);過分干燥又會導(dǎo)致磁珠開裂進而降低純化得率。通常情況下,室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥。
7. DNA純化或長度分選產(chǎn)物如需保存,可使用0.1×TE Buffer洗脫,產(chǎn)物于4°C可保存2天,-20°C可保存1個月。
五、關(guān)于文庫擴增(Library Amplification)
1. 本試劑盒中的文庫擴增組分由本公司第二代高保真DNA聚合酶所組成,在第—代的基礎(chǔ)上,大大增強了擴增的均一性,即使是低拷貝的基因,也能進行無偏好性地擴增。
2. 文庫擴增步驟需要嚴格控制擴增循環(huán)數(shù)。循環(huán)數(shù)不足,將導(dǎo)致文庫產(chǎn)量低;循環(huán)數(shù)過多,又將導(dǎo)致文庫偏好性增加、重復(fù)度增加、嵌合產(chǎn)物增加、擴增突變積累等多種不良后果。表2列舉了使用本試劑盒進行文庫擴增,Input Total RNA量與相應(yīng)擴增循環(huán)數(shù)的推薦。
表2 Input Total RNA量與擴增循環(huán)數(shù)推薦表*
Input Total RNA | Number of cycles | |
Non-stranded | Stranded | |
100 ng | 12-14 | 14-16 |
1000 ng | 10-12 | 12-14 |
≥2000 ng | 8-10 | 10-12 |
【注】:*由于不同物種和組織所提取的Total RNA中,mRNA的含量差異較大。實驗中需根據(jù)建庫起始量、物種類型及樣本處理情況適當(dāng)調(diào)整擴增循環(huán)數(shù)。
六、關(guān)于文庫質(zhì)檢(Library Quality Analysis)
1. 通常情況下,構(gòu)建好的文庫可通過長度分布檢測和濃度檢測來進行質(zhì)量評價。
2. 文庫濃度檢測可使用:基于雙鏈DNA熒光染料的方法,如Qubit®、PicoGreen®等;基于qPCR定量的方法。
3. 推薦使用qPCR方法進行文庫濃度檢測:Qubit®等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測定方法,無法有效區(qū)分單端連接Adapter的產(chǎn)物、兩端均未連接Adapter的產(chǎn)物及其他不完整雙鏈結(jié)構(gòu)產(chǎn)物;qPCR定量基于PCR擴增原理,僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫(即可測序的文庫),可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測序文庫的干擾。
4. 文庫濃度檢測不可使用:基于光譜檢測的方法,如NanoDrop®等。
5. 文庫長度分布檢測,可通過Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細管電泳或微控流原理的設(shè)備進行檢測。
使用方法
一、自備材料
1. 純化磁珠:Hieff NGS® DNA Selection Beads(Cat#12601)或AMPure XP Beads(Cat#A63880)或其他等效產(chǎn)品。
2. RNA質(zhì)控:Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico Chip或其他等效產(chǎn)品。
3. Adapters:詳情請咨詢?nèi)A大智造或本公司。
4. 文庫質(zhì)檢:Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效產(chǎn)品;文庫定量試劑。
5. 其他材料:無水乙醇、無菌超純水、低吸附槍頭、PCR管、磁力架、PCR儀等。
二、操作流程
圖1 mRNA建庫試劑盒操作流程
三、操作步驟
3.1 mRNA純化和片段化(mRNA Purification and Fragmentation)
1. 將mRNA Capture Beads從2-8℃取出,靜置使其溫度平衡至室溫,約30 min。
2. 準(zhǔn)備一個Nuclease free離心管,取0.1-4 μg總RNA,用Nuclease free水將體積補至50 μL,冰上放置備用。
3. 顛倒或旋渦振蕩混勻磁珠,吸取50 μL磁珠懸液加入至50 μL總RNA樣品中,用移液器吹打6次,使其充分混勻。
4. 將磁珠與RNA的混合物置于PCR儀中,65℃,5 min;4℃,hold,使得RNA變性。
5. 室溫孵育5 min,使mRNA與磁珠*結(jié)合。
6. 將樣品置于磁力架中,室溫靜置5 min,使mRNA與總RNA分離,小心移除上清。
7. 將樣品從磁力架上取出,用200 μL Beads Wash Buffer重懸磁珠,移液器反復(fù)吹打6次以*混勻。將樣品置于磁力架中,室溫靜置5 min,小心移除上清。
8. 重復(fù)步驟7,共洗滌兩次。
9. 將樣品從磁力架上取出,加入50 μL Tris Buffer重懸磁珠,用移液器反復(fù)吹打6次以*混勻。
10. 將樣品置于PCR儀中,80℃,2 min;25℃,hold,將mRNA洗脫下來。
11. 將樣品從PCR儀中取出,加入50 μL Beads Binding Buffer,用移液器反復(fù)吹打6次以*混勻。
12. 室溫放置5 min,使mRNA結(jié)合到磁珠上。
13. 將樣品置于磁力架中,室溫靜置5 min,小心移除上清。
14. 將樣品從磁力架上取出,用200 μL Beads Wash Buffer重懸磁珠,移液器反復(fù)吹打6次以*混勻,將樣品重新放回至磁力架中,室溫靜置5 min,吸掉全部上清。
【注】:后需要用10 μL移液器吸干凈殘留液體。
15.將樣品從磁力架上取出,用18.5 μL Frag/Prime buffer重懸磁珠,用移液器吹打6次以*混勻;將樣品置于PCR儀中(預(yù)設(shè)為94℃或85℃),可參考表3選擇片段化程序,但不同物種片段化的效果有差異,客戶可先根據(jù)自己的情況,做個片段化時間的梯度,比如94℃,5 min或85℃,6 min。使用Agilent 2100分析雙鏈cDNA純化產(chǎn)物大小。
表3 mRNA pian段化程序選擇
插入片段大小(bp) | 打斷程序 |
150-200 | 94°C,6 min; |
200-300 | 94°C,5 min; |
250-450 | 85°C,8 min; |
400-550 | 85°C,6 min; |
16. 片段化程序結(jié)束后,為防止poly(A)尾RNA與磁珠結(jié)合,請立即將樣品置于磁力架中,待溶液澄清后,轉(zhuǎn)移17 μL上清至一個新的nuclease free離心管中,立刻進入第—鏈合成反應(yīng)。
3.2 第—鏈cDNA的合成:
1. 將第—鏈合成試劑從-20°C取出,顛倒混勻后瞬離。按表4所示,配制第—鏈cDNA合成的反應(yīng)液。
表4 第—鏈cDNA合成反應(yīng)體系
名稱 | 體積(μL) |
Fragmented mRNA | 17 |
Strand Specificity Reagent | 6 |
1st Strand Enzyme Mix | 2 |
2. 使用移液器輕輕吹打混勻,瞬離將反應(yīng)液離心至管底。
3. 將上述PCR管置于PCR儀中,按照表5所示設(shè)置反應(yīng)程序,進行第—鏈cDNA的合成。反應(yīng)結(jié)束后立即進行第二鏈cDNA的合成。
表5 第—鏈cDNA合成反應(yīng)程序
溫度 | 時間 |
熱蓋 105°C | On |
25°C | 10 min |
42°C | 15 min |
70°C | 15 min |
4°C | Hold |
3.3第二鏈cDNA的合成/末端修復(fù)/加A:
1. 將第二鏈合成試劑從-20 °C取出,解凍后顛倒混勻;按照表6所示,配制第二鏈cDNA合成/末端修復(fù)/加A反應(yīng)液。
表6 第二鏈cDNA合成反應(yīng)體系
名稱 | 體積(μL) |
1st Strand cDNA | 25 μL |
2nd Strand Buffer ( dNTP or dUTP)* | 30 μL |
2nd Strand Enzyme Master Mix | 5 μL |
【注】:*如構(gòu)建普通mRNA文庫,請使用含dNTP的buffer;如構(gòu)建鏈特異性mRNA文庫,請使用含dUTP的buffer。
2. 使用移液器輕輕吹打混勻,瞬離將反應(yīng)液離心至管底。
3. 將上述PCR管置于PCR儀中,按照表7所示設(shè)置反應(yīng)程序,進行第二鏈cDNA的合成。
表7 第二鏈cDNA合成反應(yīng)程序
溫度 | 時間 |
熱蓋 105°C | on |
16°C | 30 min |
72°C | 15 min |
4°C | Hold |
3.4 接頭連接(Adapter Ligation)
該步驟可在末端修復(fù)和dA尾添加的產(chǎn)物末端,連接特定的MGI®接頭。
1. 參考注意事項三中的表1,根據(jù)Input RNA量,稀釋Adapter至合適濃度。
2. 將表8中各試劑解凍后顛倒混勻,置于冰上備用。
3. 于3.3步驟結(jié)束后的PCR管中繼續(xù)配制表8所示反應(yīng)體系。
表8 Adapter Ligation體系
名稱 | 體積(μL) |
dA-tailed DNA | 60 |
Ligation Enhancer | 30* |
Fast T4 DNA Ligase | 5 |
DNA Adapter | 5** |
【注】:*Ligation Enhancer使用前請上下顛倒、振蕩,充分混勻并瞬時離心后使用。
**請根據(jù)注意事項三中表1的提示,用0.1×TE buffer對接頭進行稀釋,接頭體積固定為5 μL。
4. 使用移液器輕輕吹打混勻,并短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。
5. 將PCR管置于PCR儀中,設(shè)置表9所示反應(yīng)程序,進行接頭連接反應(yīng):
表9 Adapter Ligation反應(yīng)程序
溫度 | 時間 |
熱蓋 | Off |
20°C | 15 min |
4°C | Hold |
【注】:當(dāng)Input DNA量較低時,可嘗試將連接時間延長一倍,這將提高連接效率。
3.5 連接產(chǎn)物純化和片段大小分選(Post Ligation Clean Up and Size Selection)
目前有兩個方案應(yīng)用于該步驟,當(dāng)插入片段<200 bp時,使用方案A;當(dāng)插入片段≥200 bp時,使用方案B。
方案A:適用于插入片段150-200 bp的文庫(如mRNA打斷方案為94°C,6 min)
1. 準(zhǔn)備工作:將Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。
2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。
3. 吸取60 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.6×,Beads:DNA=0.6:1)至Adapter Ligation產(chǎn)物中,渦旋或吹打混勻,室溫孵育5 min。
4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體,待溶液澄清后(約5 min),小心移除上清。
5. 保持PCR管始終置于磁力架中,加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠,室溫孵育30 sec后,小心移除上清。
6. 重復(fù)步驟5,總計漂洗兩次。
7. 保持PCR管始終置于磁力架中,開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂(不超過5 min)。
8. 將PCR管從磁力架中取出,加入102 μL ddH2O,渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻,室溫靜置5 min。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置,待溶液澄清后(約5 min),小心移取100 μL上清至新PCR管中,準(zhǔn)備進行第二輪純化。
9. 吸取80 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.8×,Beads:DNA=0.8:1)至Adapter Ligation產(chǎn)物中,渦旋或吹打混勻,室溫孵育5 min。
10. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體,待溶液澄清后(約5 min),小心移除上清。
11. 保持PCR管始終置于磁力架中,加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠,室溫孵育30 sec后,小心移除上清。
12. 重復(fù)步驟5,總計漂洗兩次。
13. 保持PCR管始終置于磁力架中,開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂(不超過5 min)。
14. 將PCR管從磁力架中取出,加入21 μL ddH2O,渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻,室溫靜置5 min。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置,待溶液澄清后(約5 min),小心移取20 μL上清至新PCR管中,進行PCR擴增。
方案B:適用于插入片段大于200 bp的文庫(如mRNA打斷方案為94°C,5 min或85℃,8 min)
方案B-1:接頭連接產(chǎn)物的純化
1. 準(zhǔn)備工作:將Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。
2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。
3. 吸取80 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.8×,Beads:DNA=0.8:1)至Adapter Ligation產(chǎn)物中,渦旋或吹打混勻,室溫孵育5 min。
4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體,待溶液澄清后(約5 min),小心移除上清。
5. 保持PCR管始終置于磁力架中,加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠,室溫孵育30 sec后,小心移除上清。
6. 重復(fù)步驟5,總計漂洗兩次。
7. 保持PCR管始終置于磁力架中,開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂(不超過5 min)。
8. 將PCR管從磁力架中取出,加入102 μL ddH2O,渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻,室溫靜置5 min。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置,待溶液澄清后(約5 min),小心移取100 μL上清至新PCR管中,準(zhǔn)備進行雙輪分選。
【注】:Ligation Enhancer中含有的高濃度PEG會對磁珠雙輪分選產(chǎn)生影響,所以必須經(jīng)過一輪純化后再進行雙輪分選。
方案B-2:雙輪分選
1. 請渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證混勻。
2. 根據(jù)DNA pian段長度要求,參考表10,在上述100 μL DNA中加入第—輪分選磁珠,渦旋或移液器吹打10次混勻。
表10 文庫分選推薦磁珠比例
DNA文庫插入片段大?。ǚ逯担琤p) | ~ 200 | ~ 300 | ~ 400 | ~ 500 | |
打斷條件 | 94℃,5 min | 85℃,8 min | 85℃,8 min | 85℃,6 min | |
接頭連接之后分選或文庫擴增之后分選 | 第—輪體積比 | 0.78× | 0.68× | 0.58× | 0.48× |
第二輪體積比 | 0.20× | 0.20× | 0.20× | 0.20× |
【注】:此表推薦的雙輪分選比例適用于AMPure® XP磁珠和Hieff NGS® DNA Selection Beads;表中“×”表示樣品DNA體積。如所需文庫插入片段主峰為200 bp時,若在接頭連接之后分選,樣品DNA體積為100 μL,則第—輪分選磁珠使用體積為0.78×100 μL=78 μL,第二輪分選磁珠使用體積為0.20×100 μL=20 μL。
3. 室溫孵育5 min。
4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中,待溶液澄清后(約5 min),小心轉(zhuǎn)移上清到干凈的離心管中,殘留1-2 μL溶液于管底。
5. 參考表10向上清中加入第二輪分選磁珠。
6. 渦旋混勻或移液器吹打10次混勻,室溫靜置5 min。
7. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中,待溶液澄清后(約5 min),小心移除上清。
8. 保持PCR管始終處于磁力架中,加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠,室溫孵育30 sec,小心移除上清。
9. 重復(fù)步驟8。
10. 保持PCR管始終處于磁力架中,開蓋干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂(約5 min)。
11. 將PCR管從磁力架中取出,加入21 μL ddH2O,渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻,室溫靜置5 min。
12. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后(約5 min),小心轉(zhuǎn)移20 μL上清至干凈管中。
3.6文庫擴增(Library Amplification)
該步驟將對純化或長度分選后的接頭連接產(chǎn)物進行PCR擴增富集。
1. 將表11中的試劑解凍后顛倒混勻,置于冰上備用。
2. 于無菌PCR管中配制表11所示反應(yīng)體系。
表11 接頭連接產(chǎn)物PCR反應(yīng)體系
組分名稱 | 體積(μL) |
2×Ultima HF Amplification Mix | 25 |
Primer Mix for MGI® | 5 |
Adapter Ligated DNA | 20 |
3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻,并短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。
4. 將PCR管置于PCR儀中,設(shè)置表12示反應(yīng)程序,進行PCR擴增。
表12 PCR擴增反應(yīng)程序
溫度 | 時間 | 循環(huán)數(shù) |
98°C | 1 min | 1 |
98°C | 10 sec | 參照表2(注意事項五) |
60°C | 30 sec | |
72°C | 30 sec | |
72°C | 5 min | 1 |
4°C | Hold | - |
3.7 擴增產(chǎn)物磁珠純化或分選(Post Amplification Clean Up/Size Selection)
同3.5步驟中純化操作步驟。使用Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.9×,Beads:DNA=0.9:1)純化文庫擴增產(chǎn)物。
3.8 文庫質(zhì)量控制
通常情況下,構(gòu)建好的文庫可通過濃度檢測和長度分布檢測來進行質(zhì)量評價,具體請參見注意事項六。
3.9 文庫環(huán)化
使用Hieff NGS® Fast-Pace DNA Cyclization Kit for MGI®(Cat#13341)或其他等效產(chǎn)品進行文庫單鏈環(huán)化反應(yīng)。
附錄一:mRNA pian段化
圖2. mRNA不同打斷時間對應(yīng)的雙鏈cDNA pian段范圍。取1 μg Universal Human Reference RNA,經(jīng)mRNA提取試劑盒提取后,分別以94°C,6 min、85℃,8 min和85℃,5 min處理。打斷后mRNA進行雙連cDNA的合成,經(jīng)過1.8×磁珠回收后,通過Agilent 2100 Bioanalyzer進行檢測。
【注】:本結(jié)果使用的RNA是Agilent公司的Universal Human Reference RNA,若使用其他來源的RNA,優(yōu)化打斷時間。