產(chǎn)品信息
 

產(chǎn)品描述
 

本產(chǎn)品是用于lllumina^®平臺高通量測序文庫濃度定量的試劑盒，提供定量所需DNA標(biāo)準(zhǔn)品，包含經(jīng)梯度稀釋的六份450 bp的雙鏈DNA//片段溶液，濃度為20 pM-0.0002 pM。本產(chǎn)品可搭配qPCR Master Mix（Cat#12302: 包含定量所需的qPCR Master Mix、定量擴(kuò)增引物和參比染料ROX。擴(kuò)增引物根據(jù)NGS文庫接頭序列P5和P7設(shè)計，可保證特異性擴(kuò)增雙端接頭完整的文庫分子；qPCR Master Mix是基于抗體法熱啟動的染料法qPCR預(yù)混液。）可對不同長度、不同GC或AT含量樣本中高效、特異擴(kuò)增，實現(xiàn)精確定量。

本試劑盒已經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量和功能檢測，試劑盒所有組分均達(dá)到DNA污染控制的嚴(yán)格質(zhì)控要求，應(yīng)用于NGS文庫定量精確靈敏，且批間穩(wěn)定，結(jié)果重現(xiàn)性優(yōu)異。

產(chǎn)品組分
 

注意：

1. 根據(jù)儀器類型選擇合適的參比染料ROX。
 

2. qPCR Primer Mix 中包含一對引物，序列如下，可預(yù)先通過引物序列確認(rèn)文庫是否可以被該引物對擴(kuò)增。

Primer 1：5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GA-3'

Primer 2：5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA-3'

運輸與保存方法
 

冰袋運輸。所有組分應(yīng)-20℃保存，qPCR Master Mix與ROX避光保存，有效期6個月；如短期內(nèi)反復(fù)使用，qPCR Master Mix可解凍后于4℃避光暫存，有效期3個月。

注意事項
 

一、關(guān)于操作
 

1. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

2. 請于使用前確保產(chǎn)品凍融和*混勻，短暫離心收集至管底后置于冰上備用。

3. 為保證產(chǎn)品品質(zhì)，避免反復(fù)凍融超過30次！

4. 為避免樣品交叉和氣溶膠污染，推薦使用帶濾芯的槍頭，吸取不同樣品時請更換槍頭。

5. 試劑吸取時應(yīng)保證槍頭適當(dāng)深入液體，排出時應(yīng)確認(rèn)槍頭無殘留。

二、關(guān)于文庫稀釋
 

文庫需稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線有效Ct范圍內(nèi)進(jìn)行定量，稀釋比例可參照過往經(jīng)驗或使用其他測定方式測定的濃度作為參考（如NanoDrop^®，Qubit^®或Bioanalyzer）。使用本試劑盒可定量的文庫濃度范圍參見下表。

由于DNA在非緩沖環(huán)境中易降解，因此應(yīng)使用緩沖稀釋液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0 [25℃] + 0.05% Tween 20）稀釋文庫，切勿使用水作為稀釋液。測定時，文庫應(yīng)現(xiàn)測定現(xiàn)稀釋，置于冰上待測，切勿使用以往配制儲存的稀釋后文庫。

表1  DNA Standard濃度

三、污染與陰性對照（Contamination and No-template Controls）
 

1. 進(jìn)行qPCR實驗時，應(yīng)保證良好的實驗操作規(guī)范，以防對工作區(qū)域、試劑、耗材、儀器、DNA標(biāo)準(zhǔn)品等造成污染。推薦將反應(yīng)體系配制區(qū)和模板制備區(qū)進(jìn)行物理隔離，并定時使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑對各實驗區(qū)域進(jìn)行擦拭清理。

2. 反應(yīng)體系配制過程中DNA Standards的加入應(yīng)按照從低濃度至高濃度（DNA Standard 6至1）的順序進(jìn)行，每次移液都應(yīng)更換新的槍頭，以避免氣溶膠污染。

3. 每次實驗都應(yīng)平行進(jìn)行NTC陰性對照反應(yīng)，配合融解曲線進(jìn)行擴(kuò)增特異性和體系污染程度分析。因擴(kuò)增引物序列為Illumina^®平臺固定序列而非qPCR引物序列，且擴(kuò)增循環(huán)數(shù)較多，NTC陰性對照反應(yīng)出現(xiàn)引物二聚體擴(kuò)增進(jìn)而產(chǎn)生Ct屬正常情況。正常情況下Ct (NTC) > Ct (DNA Standard 6) + 3。

四. 擴(kuò)增曲線基線設(shè)置
 

因DNA Standard 1的摩爾濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常規(guī)qPCR模板，其Ct往往非常小。而大部分qPCR儀器都默認(rèn)將3-15循環(huán)設(shè)置為基線（Baseline），有時會將DNA Standard 1的Ct值誤認(rèn)為是測定時的噪聲背景，繼而影響標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。手動設(shè)置基線（Baseline）為1-3循環(huán)可以有效避免這種情況發(fā)生。

五、文庫長度矯正
 

為避免片段長度對文庫定量的影響，需要在定量結(jié)果計算時，對文庫長度進(jìn)行矯正。根據(jù)文庫熒光染料SYBR^® Green I結(jié)合DNA后產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與DNA分子量成正比的原則，根據(jù)以下公式進(jìn)行文庫濃度長度矯正。

矯正后的稀釋文庫濃度（pM）= [450 bp /文庫平均長度（bp）] × 稀釋文庫的濃度（pM）

六、熔解曲線分析
 

熔解曲線在配合NTC陰性對照進(jìn)行污染程度分析以及確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)曲線大有效Ct時至關(guān)重要，推薦每次實驗都進(jìn)行熔解曲線采集步驟。本產(chǎn)品DNA Standards產(chǎn)生的熔解曲線呈現(xiàn)特征單峰。

圖1  文庫標(biāo)準(zhǔn)品熔解曲線

使用方法
 

一、解凍試劑
 

將Hieff NGS^® qPCR Mix，Primer Mix，DNA Standards 1-6，文庫稀釋液（10 mM Tris-HCl, pH 8.0 + 0.05% Tween 20），ROX Dye（如需要）從冰箱中拿出，冰浴解凍。各試劑解凍后，渦旋混勻，短暫離心后置于冰上備用。

二、稀釋文庫
 

使用文庫稀釋液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0 [25℃] + 0.05% Tween 20）對待測文庫進(jìn)行適當(dāng)稀釋。推薦稀釋度為1:1000-1:100000。對于高濃度文庫，可額外設(shè)置3個2倍稀釋梯度，如按1:1000稀釋文庫，可額外設(shè)置1:2000，1:4000，1:8000稀釋比例，以保證測定值在試劑盒所提供的標(biāo)曲范圍內(nèi)。

三、反應(yīng)體系配制
 

于反應(yīng)管中配制如下體系，上下顛倒或渦旋振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。

表2  qPCR反應(yīng)體系

注：1）每個反應(yīng)至少設(shè)置3個平行；2）推薦進(jìn)行20 μL反應(yīng)體系，如需進(jìn)行10 μL反應(yīng)，則將體系各組分等比減少；3）*在陰性對照反應(yīng)管中加入ddH₂O；在樣品反應(yīng)管中加入稀釋后的文庫；在標(biāo)準(zhǔn)曲線反應(yīng)管中加入DNA Standards；4）根據(jù)儀器選擇合適的ROX，推薦使用量為0.5 μL。

四、qPCR運行程序
 

將反應(yīng)管置于qPCR儀中，按下述條件設(shè)置qPCR反應(yīng)程序，并運行（熔解曲線可根據(jù)儀器默認(rèn)即可）。

表3  qPCR程序

注：*當(dāng)文庫平均長度>700 bp時，建議延伸時間延長至90 sec。

五、數(shù)據(jù)分析
 

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
 

1）根據(jù)復(fù)孔間Ct差異≤0.2的原則，對DNA Standards原始Ct進(jìn)行過濾，并計算平均Ct。

2）使用有效范圍內(nèi)的Ct（作為縱坐標(biāo)）和Log[pM]（作為橫坐標(biāo)）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。參照NTC陰性對照Ct確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct有效范圍。

如Ct (NTC) > Ct (DNA Standard 6) + 3，則大有效Ct為Ct (DNA Standard 6)，應(yīng)使用DNA Standard 1-6所產(chǎn)生的Ct繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

如Ct (DNA Standard 6) + 3 > Ct (NTC) > Ct (DNA Standard 5) + 3，則大有效Ct為Ct (DNA Standard 5)，應(yīng)使用DNA Standard 1-5所產(chǎn)生的Ct繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

如Ct (DNA Standard 5) + 3 > Ct (NTC) > Ct (DNA Standard 4) + 3，則大有效Ct為Ct (DNA Standard 4)，應(yīng)使用DNA Standard 1-4所產(chǎn)生的Ct繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

基于定量準(zhǔn)確性考慮，請至少使用4個Ct (DNA Standards)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如Ct (DNA Standard 4) + 3 > Ct (NTC)，提示定量體系存在嚴(yán)重污染，需更換體系中所有組分后重復(fù)試驗。

3）繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R²應(yīng)不低于0.99，斜率應(yīng)位于-3.1至-3.6之間（表示擴(kuò)增效率位于90%-110%之間）。如標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)不佳，應(yīng)重復(fù)試驗。

2. 文庫濃度計算
 

稀釋文庫的Ct只有位于標(biāo)準(zhǔn)曲線有效Ct范圍之內(nèi)才可用于濃度計算，同時應(yīng)對文庫進(jìn)行長度矯正。可根據(jù)下述公式計算原始文庫濃度（nM）：

原始文庫濃度（nM）= [450 bp /文庫平均長度（bp）] × 稀釋文庫的濃度（pM）× 稀釋倍數(shù)/1000

六、使用案例
 

用Hieff NGS^® DNA Library Quantification Kit for Illumina^®定量嗜鹽桿菌基因組DNA文庫，文庫GC含量為70%，長度450 bp。將文庫稀釋10000倍上機(jī)檢測，結(jié)果如下圖所示。根據(jù)標(biāo)曲及公式，文庫終濃度=4.37 pM × 稀釋倍數(shù)10000=43.7 nM。

圖2  文庫qPCR精確定量

相關(guān)產(chǎn)品
 

HB190103