產(chǎn)品信息

Hieff Clone® Plus Multi One Step Cloning Kit是一款簡便、快速、高效的DNA定向克隆產(chǎn)品，該試劑盒可以將PCR產(chǎn)物定向克隆至任何載體的任何位點(diǎn)，可高效克隆50 bp-10 kb片段。將載體線性化，并在插入片段正、反向PCR引物5’端引入15-25 bp的線性化載體末端同源序列，使得插入片段PCR產(chǎn)物5’和3’末端分別帶有與線性化載體兩末端對應(yīng)的*一致的序列。PCR產(chǎn)物和線性化載體在重組酶的作用下，僅需50℃反應(yīng)20 min即可進(jìn)行轉(zhuǎn)化，完成定向克隆。克隆陽性率可達(dá)95%以上。

試劑盒中2×Hieff Clone® MultiS Enzyme Premix預(yù)混了重組酶和重組反應(yīng)所需緩沖液，并添加了*的重組增強(qiáng)因子，可顯著提高重組克隆效率。使用該試劑盒，可以一次實(shí)現(xiàn)多至5個片段的順序拼接克隆。

產(chǎn)品組分

快速克隆；定向克隆；定點(diǎn)突變。

運(yùn)輸與保存方法

冰袋運(yùn)輸。-20℃保存，有效期1年。

注意事項(xiàng)

1）為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。
2）本產(chǎn)品僅作科研用途！

實(shí)驗(yàn)流程

① 載體線性化：酶切或反向PCR制備線性化載體。

② 插入片段的制備：由PCR制備，所用擴(kuò)增引物在設(shè)計時需在其5’端添加同源序列（圖中以紅色、黃色、紫色和綠色標(biāo)記)，使得擴(kuò)增產(chǎn)物之間以及擴(kuò)增產(chǎn)物與線性化載體之間各有一段同源序列。

一. 制備線性化載體

選擇合適的克隆位點(diǎn)，并對載體進(jìn)行線性化。建議盡量選擇無重復(fù)序列且GC含量均勻的區(qū)域進(jìn)行克隆。載體克隆位點(diǎn)上下游25 bp區(qū)域內(nèi)GC含量均在40%-60%范圍內(nèi)最佳。線性化載體可通過限制性內(nèi)切酶酶切或反向PCR擴(kuò)增獲得。

1.酶切制備線性化載體
1）雙酶切線性化：線性化*，轉(zhuǎn)化背景低。建議使用。
2）單酶切線性化：線性化程度較差。可適當(dāng)延長酶切時間以降低轉(zhuǎn)化背景。
【注】：不含插入片段的假陽性克隆是由未線性化環(huán)狀載體轉(zhuǎn)化而形成的。若這種假陽性克隆比例較高，建議重新制備線性化載體。

2.反向PCR擴(kuò)增制備線性化載體

建議使用高保真聚合酶（如：Hieff Canace^® High-Fidelity DNA Polymerase，Cat No. 10135ES）進(jìn)行載體擴(kuò)增，以減少擴(kuò)增突變的引入。PCR擴(kuò)增模板應(yīng)盡量使用預(yù)線性化質(zhì)粒，以防止殘留環(huán)狀質(zhì)粒模板對克隆陽性率的影響。

Hieff Clone^®重組反應(yīng)體系兼容幾乎所有酶切反應(yīng)體系和常規(guī)PCR反應(yīng)體系，當(dāng)載體酶切產(chǎn)物或反向PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純度較高時，可以無需純化，直接進(jìn)行重組反應(yīng)。但純度較低且有可能含有未線性化環(huán)狀質(zhì)粒時，建議使用高質(zhì)量的試劑盒對線性化載體進(jìn)行膠回收純化，以提高產(chǎn)物純度并去除一部分未線性化的環(huán)狀載體，有利于提高重組效率。

二. PCR擴(kuò)增制備插入片段

1.設(shè)計擴(kuò)增引物

Hieff Clone® 引物設(shè)計方式：通過在插入片段正、反向PCR引物的5’端引入15-25 bp（不包括酶切位點(diǎn)）的線性化載體末端同源序列，使得插入片段PCR產(chǎn)物5’和3’末端分別帶有與線性化載體兩末端對應(yīng)的*一致的序列。

推薦使用翌圣無縫克隆引物設(shè)計軟件（122.112.245.84:8080/hieff-clone/），自動生成插入片段的擴(kuò)增引物。若手動設(shè)計，可參照以下實(shí)例。以在pUC18載體（注：與該試劑盒中提供的C組分不同，C組分為pUC19）的EcoR I 和Hind III 酶切位點(diǎn)間插入三段基因的引物設(shè)計為例，引物具體設(shè)計方案如下：

首先設(shè)計第一片段的正向擴(kuò)增引物和第三片段的反向擴(kuò)增引物(與載體相鄰的兩個插入片段)。

第一片段正向擴(kuò)增引物設(shè)計方式：

5’—上游載體末端同源序列+酶切位點(diǎn)（可保留或刪除）+第一片段基因特異性正向擴(kuò)增序列—3’

第三片段反向擴(kuò)增引物設(shè)計方式：

3’—第三片段基因特異性反向擴(kuò)增序列+酶切位點(diǎn)（可保留或刪除）+下游載體末端同源序列—5’

【注】：
① 基因特異性正/反向擴(kuò)增序列即常規(guī)插入片段正/反向擴(kuò)增引物序列；

② 上游/下游載體末端同源序列為線性化載體最末端序列（用于同源重組），GC含量40%-60%為佳。

其次設(shè)計第一片段的反向擴(kuò)增引物和第二片段的正向擴(kuò)增引物。用于片段之間進(jìn)行重組的同源序列可以添加至前方片段的反向擴(kuò)增引物中，也可以添加至后方片段的正向擴(kuò)增引物中，還可以兩片段各添加一部分。以將同源序列添加至前方片段 （第一片段）的反向擴(kuò)增引物中為例，引物具體設(shè)計方案如圖3所示：
第一片段反向擴(kuò)增引物設(shè)計方式：
3’—第一片段基因特異性反向擴(kuò)增序列+第二片段5’端同源序列—5’
第二片段正向擴(kuò)增引物設(shè)計方式：
5’—第二片段基因特異性正向擴(kuò)增序列—3’

【注】：
① 基因特異性正/反向擴(kuò)增序列即常規(guī)插入片段正/反向擴(kuò)增引物序列；
② 第二片段5’端同源序列即用于第一片段與第二片段進(jìn)行重組的添加序列。

最后設(shè)計第二片段的反向擴(kuò)增引物和第三片段的正向擴(kuò)增引物。設(shè)計方式與第一片段的反向擴(kuò)增引物和第二片段的正向擴(kuò)增引物設(shè)計方式一致。          

【注】：最終引物長度超過40 bp，建議選用PAGE純化方式進(jìn)行引物合成。計算擴(kuò)增引物退火溫度時，只需計算基因特異性擴(kuò)增序列的Tm值，載體末端同源序列不應(yīng)參與計算，為了得到高效率克隆，建議Tm≥48℃。

2.插入片段PCR擴(kuò)增

插入片段擴(kuò)增可用任意PCR酶擴(kuò)增，無需考慮產(chǎn)物末端有無A尾 (重組過程中將被去除，在最終載體中不會出現(xiàn))。但為了減少擴(kuò)增突變的引入，建議使用高保真聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增（Hieff Canace® High-Fidelity DNA Polymerase，Cat No. 10135ES）。

PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取少量產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以檢驗(yàn)擴(kuò)增產(chǎn)量和特異性。Hieff Clone®重組反應(yīng)體系兼容常規(guī)PCR反應(yīng)體系。因此，如果擴(kuò)增模板不是與載體抗性相同的環(huán)狀質(zhì)粒，且PCR產(chǎn)物電泳條帶單一，則擴(kuò)增產(chǎn)物可以無需純化，直接用于重組反應(yīng)。但PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純度較低時，建議使用高質(zhì)量的試劑盒對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化，以提高產(chǎn)物純度，有利于提高重組效率。

三. 線性化載體與插入片段濃度測定

推薦使用瓊脂糖凝膠電泳比較條帶亮度的方法對DNA進(jìn)行定量。將線性化載體和插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物做數(shù)個等體積稀釋梯度，原始產(chǎn)物和稀釋后產(chǎn)物各取1 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DNA Marker）比較條帶亮度以確定其近似濃度。

四. 重組反應(yīng)

1. 線性化載體與插入片段使用量計算

Hieff Clone^® Plus Multi重組反應(yīng)體系最適DNA使用量為每片段（包括線性化載體）0.03 pmoL。該摩爾數(shù)對應(yīng)的DNA質(zhì)量可由以下公式粗略計算獲得：
每片段最適使用量= [0.02×載體堿基對數(shù)]ng (0.03 pmoL)

例如，將長度為0.5kb、1kb、2 kb三插入片段克隆至長度為5 kb的載體時，各片段最適使用量應(yīng)為：
線性化載體最適使用量：0.02 × 5000 = 100 ng；
0.5kb插入片段最適使用量應(yīng)為：0.02 × 500 = 10 ng；
1 kb插入片段最適使用量應(yīng)為：0.02 × 1000 = 20 ng；
2 kb插入片段最適使用量應(yīng)為：0.02 × 2000 = 40 ng。

【注】：
1）插入片段DNA使用量應(yīng)大于10 ng。當(dāng)使用上述公式計算DNA最適使用量低于這個值時，直接使用10 ng即可。
2）線性化載體的使用量應(yīng)在50-200 ng之間。當(dāng)使用上述公式計算最適使用量超出這個范圍時，則選擇低或高使用量即可。
3）線性化載體和插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物未純化，直接使用時，使用總體積應(yīng)不超過反應(yīng)體系體積的1/5，如20 μL體系不超過4 μL。

2.反應(yīng)體系（推薦冰上配制，各組分使用前需混勻）

【注】：
1）X和Y分別是根據(jù)公式計算得到線性化載體和插入片段用量。
2）陰性對照-1可用來確認(rèn)線性化載體有無環(huán)狀質(zhì)粒殘留，可選擇性進(jìn)行。
3）當(dāng)插入片段擴(kuò)增模板是與載體抗性相同的環(huán)狀質(zhì)粒時，可用陰性對照-2來確認(rèn)有無環(huán)狀質(zhì)粒模板殘留，可選擇性進(jìn)行。
4）試劑盒中提供陽性對照反應(yīng)所需組分（B組分和C組分），可用來排除其他實(shí)驗(yàn)材料及操作因素的影響，可選擇性進(jìn)行。

3.重組反應(yīng)

1）體系配制完成后，用移液器輕輕吸打混勻各組分，短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。
2）置于50℃反應(yīng)20 -50 min。當(dāng)插入片段總和＞5 kb時，建議提高孵育時間到30-50 min可以增大重組效率。
注：建議在PCR儀或水浴鍋等溫控精確的儀器上進(jìn)行反應(yīng)。

3）待反應(yīng)完成后，建議將反應(yīng)管置于冰上冷卻5 min，以防溫度過高降低感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率。

4）反應(yīng)產(chǎn)物可直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化，也可儲存于-20℃，待需要時解凍轉(zhuǎn)化。

五. 重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、涂板

1）在冰上解凍克隆感受態(tài)細(xì)胞（如：DH5α Chemically Competent Cell，Cat No. 11802ES）。

2）取10 μL冷卻重組產(chǎn)物，加入到100 μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈管壁數(shù)下混勻，在冰上放置30 min。

3）42℃熱激90秒，冰浴孵育2 min。

4）加入900 μL SOC或LB培養(yǎng)基，37℃孵育10 min充分復(fù)蘇。37℃，200 rpm，搖菌45 min。
5）5000 rpm離心3 min，棄掉900 μL上清。用剩余培養(yǎng)基將菌體重懸，用無菌涂布棒在含有正確抗性的平板上輕輕涂勻。待菌液被吸收，將平板倒置，于37℃過夜培養(yǎng)。

六. 克隆鑒定

方便快捷的方法是菌落PCR。用無菌的槍頭或牙簽將單個菌落挑至20-50 μL LB培養(yǎng)基中混勻，直接取1 μL作為PCR模板。推薦至少用一條通用測序引物進(jìn)行菌落PCR，這樣可以避免PCR假陽性的產(chǎn)生。后續(xù)也可做酶切或測序鑒定。

應(yīng)用實(shí)例

圖4. Hieff Clone® Plus Multi One Step Cloning Kit進(jìn)行三片段克隆。

A：重組轉(zhuǎn)化平板。B：插入片段和載體濃度檢測電泳圖。C：PCR方法鑒定每個單片段和最終連接基因。箭頭指示目的條帶。載體：pCAMIBA1302，10 kb，三個插入片段長度：1 kb，1.5 kb和2.5 kb，重組反應(yīng)條件：50℃，20 min。

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