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產品簡介
| 供貨周期 | 現貨 | 規格 | 10 mL |
|---|---|---|---|
| 貨號 | 20502ES10 | 應用領域 | 生物產業 |
產品介紹
產品信息
產品名稱 | 產品編號 | 規格 | 價格（元） | *（元） |
HisSep Ni-NTA Agarose Resin （His標簽蛋白瓊脂糖純化樹脂） | 20502ES10 | 10 mL | 678.00 | 498.00 |
HisSep Ni-NTA Agarose Resin （His標簽蛋白瓊脂糖純化樹脂） | 20502ES50 | 50 mL | 2848.00 | 2098.00 |
HisSep Ni-NTA Agarose Resin （His標簽蛋白瓊脂糖純化樹脂） | 20502ES60 | 100 mL | 5328.00 | / |
HisSep Ni-NTA Agarose Resin （His標簽蛋白瓊脂糖純化樹脂） | 20502ES80 | 2×500 mL | 42686.00 | / |
產品描述
HisSep Ni-NTA Agarose Resin以高度交聯的4%瓊脂糖凝膠為基質，通過化學方法偶聯四配位的氮川三乙酸（NTA）為配體，螯合鎳離子（Ni2+）后，形成非常穩定的八面體結構，鎳離子處于八面體的中心，這樣的結構可保護鎳離子免受小分子的進攻，與Ni-IDA樹脂相比，更加穩定，可以耐受一定濃度的還原劑、變性劑或耦合劑等苛刻條件。已經成為實驗室純化His標簽蛋白*的樹脂之一。
產品性質
基質（Matrix） | 高度交聯的4%瓊脂糖凝膠 |
粒徑（Bead size） | 45-165 µm |
載量（Capacity） | ＞40 mg 6×His-tagged protein/mL基質 |
耐壓（Tolerance Pressuremax） | 0.1 MPa，1 bar |
儲存緩沖液（Buffer） | 含20%乙醇的1×PBS |
運輸和保存方法
冰袋運輸。4℃保存。有效期2年。
注意事項
1) 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
2）本產品僅作科研用途！
使用方法
一、純化流程
1 緩沖液的準備
緩沖液使用原理：低咪唑上樣，高咪唑洗脫，或者高pH上樣，低pH洗脫。Buffer 在使用前最好用0.22 µm或0.45 µm濾膜過濾除菌。可溶性標簽蛋白純化所需配方詳見附表1。包涵體標簽蛋白純化所需緩沖液及配方詳見附表2。
2 樣品準備
2.1 細菌表達的蛋白（本說明以細菌表達的蛋白純化為例）
1）挑取單菌落到含有適合抗性的LB培養基中，根據載體說明加入相應的誘導劑誘導相應的時間。
2）表達結束后，將培養液轉至離心瓶，7000 rpm，離心15 min，收集菌體，然后加入1/10體積的裂解液（Lysis buffer）和PMSF（PMSF在破碎前加入，其終濃度為1 mM），同時也可加入其他蛋白酶抑制劑，但不能影響目的蛋白與樹脂的結合。
3）之后加入，使其工作濃度為1 mg/mL。【注】如果表達的宿主細胞內含pLysS或pLysE，可以不加入。
4）將菌體沉淀懸浮起來（如果菌液濃度高，可考慮加入10 µg/mL RNase A和5 µg/mL DNase I），混勻，置于冰上超聲破碎細胞，至菌液基本保持澄清。
5）收集上述澄清蛋白液，10000 rpm，4℃離心20-30 min。取上清0.22 µm或0.45 µm濾膜過濾后置于冰上備用或-20℃保存。
2.2 酵母、昆蟲和哺乳細胞分泌表達的可溶性蛋白
將細胞培養液轉移至離心瓶，5000 rpm離心10 min，收集上清。如上清中不含EDTA、和還原劑等，即可直接上柱純化；如含有EDTA、和還原劑等物質，則需用1×PBS 4℃下透析后方可上柱。
【注】對于大量體積的上清，需加入硫酸銨進行沉淀濃縮，之后經1×PBS 4℃下透析后上柱。
2.3 包涵體蛋白純化（以細菌為例）
1）將培養液轉移至離心瓶，7000 rpm，離心15 min，收集菌體去上清。
2）按照菌體：裂解液=1:10（w/v）的比例將菌體充分懸浮，混勻，冰浴超聲破碎。
3）將破碎液轉移至離心管，10000 rpm，4℃離心20-30 min，去上清。可重復步驟2）和3）一次。
4）按照菌體：裂解液（含8 M尿素）=1:10（w/v）的比例將包涵體充分懸浮。
5）變性條件下純化His標簽蛋白純化。
3.樣品純化
1）裝柱：將HisSep Ni-NTA Agarose Resin借助重力的作用裝入合適的純化柱中。
2）清洗：3-5倍柱體積去離子水沖洗色譜柱。
3）平衡：至少5倍柱體積的Lysis Buffer 平衡色譜柱。
4）上樣：注意控制加樣速度，確保目的蛋白與Ni2+充分接觸，以提高純化得率。
【注】注意收集流出液，用于后續SDS-PAGE檢測蛋白的結合情況。
5）平衡/洗雜：Wash Buffer 平衡柱子，直到紫外吸收達到一個穩定的基線（一般至少10-15個柱體積）。注意收集流出液。
【注】在樣品和結合緩沖液中加入低濃度咪唑可以提高樣品純度。
6）洗脫：使用5-10倍柱體積Elution Buffer洗脫，收集洗脫液即目的蛋白溶液。
7）清洗：依次用3倍柱體積的Lysis Buffer和5倍柱體積的去離子水清洗樹脂。
【注】建議在清洗之前用更高濃度咪唑（如500 mM）*清洗純化柱上結合的雜蛋白。
8）保存：5倍柱體積的20%乙醇平衡樹脂，最后將樹脂保存在20%乙醇的1×PBS中，置于4℃保存。
4 SDS-PAGE檢測
將純化過程中得到的樣品（包括原始樣品、流出組分、洗雜及洗脫組分等）利用SDS-PAGE進行檢測，判定其純化效果。
二、在位清洗
當填料使用過程中發現反壓過高（＞0.5 Mpa）或者填料上面出現明顯的污染時，需對其進行在位清洗（Cleaning-in-Place，CIP）。在位清洗時，先把Ni2+脫掉，清洗結束后，將填料保存在20%乙醇中，后者重新掛Ni后再保存在20%乙醇中。建議按照下面操作去除填料上殘留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。
1 .去除強疏水結合的蛋白，脂蛋白和脂類
使用30%異丙醇清洗5-10個柱體積，接觸時間為15-20 min可以去除此類污染物。之后再用去離子水清洗10倍柱體積。也可以選擇使用含有去污劑的酸性或者堿性溶液清洗填料2倍柱體積。例如含有0.1-0.5%非離子去污劑的0.1 M醋酸溶液，接觸時間為1-2 h。去污劑處理后，需用70%的乙醇清洗5倍柱體積，*去除去污劑。最后利用去離子水清洗10倍柱體積。
2 .去除離子作用結合的蛋白
使用1.5 M NaCl 溶液接觸10-15 min，之后用去離子水清洗10倍柱體積。
（三）填料再生
當填料使用過程中發現反壓過高，填料上面出現明顯的污染，或填料載量明顯變低時，需要對其進行鎳離子剝離及重新掛鎳處理，即填料再生。按照下面操作流程進行：
1）使用5倍柱體積去離子水清洗填料；
2）使用5倍柱體積100mM EDTA（pH 8.0）剝落鎳離子；
3）使用10倍柱體積去離子水清洗填料；
4）使用0.5M NaOH清洗5倍柱體積，停留10-15min；
5）使用10倍柱體積去離子水清洗填料；
6）使用3-5倍柱體積100mM NiSO4再生掛鎳；
7）去離子水清洗10倍柱體積。
填料再生后，可立即使用，也可保存在20%乙醇中，置于4℃備用。
附表1 可溶性His標簽蛋白純化所需緩沖液及配方
緩沖液名稱 | 配方 | 配制1 L溶液所需各種試劑量 |
Lysis Buffer pH8.0 | 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 10 mM imidazole NaOH調pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm過濾除菌 | NaH2PO4 ·2H2O 7.8 g NaCl 17.54 g Imidazole 0.68 g |
Wash Buffer pH8.0 | 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 20 mM imidazole NaOH調pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm過濾除菌 | NaH2PO4 ·2H2O 7.8 g NaCl 17.54 g Imidazole 1.36 g |
Elution Buffer pH8.0 | 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 250 mM imidazole NaOH調pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm過濾除菌 | NaH2PO4 ·2H2O 7.8 g NaCl 17.54 g Imidazole 17.0 g |
附表2 包涵體His標簽蛋白純化所需緩沖液及配方
緩沖液名稱 | 配方 | 配制1L溶液所需各種試劑量 |
Lysis Buffer pH8.0 | 8 M Urea 100 mM NaH2PO4 100 mM Tris·HCl 鹽酸溶液調pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm過濾除菌 | Urea 480.5 g NaH2PO4 ·2H2O 15.6 g Tris 15.76 g |
Wash Buffer pH6.3 | 8 M Urea 100 mM NaH2PO4 100 mM Tris·HCl 鹽酸溶液調pH至6.3，0.22 µm或0.45 µm過濾除菌 | Urea 480.5 g NaH2PO4 ·2H2O 15.6 g Tris 15.76 g |
Elution Buffer pH4.5 | 8 M Urea 100 mM NaH2PO4 100 mM Tris·HCl 鹽酸溶液調pH至4.5，0.22 µm或0.45 µm過濾除菌 | Urea 480.5 g NaH2PO4 ·2H2O 15.6 g Tris 15.76 g |
附表3 HisSep Ni-NTA Agarose Resin試劑耐受情況
試劑種類 | 濃度 |
還原劑 | 5 mM DTE 0.5-1 mM DTT 20 mM β-mercaptoethanol 5 mM TCEP 10 mM reduced glutathione |
變性劑 | 8 M urea 6 M Gua-HCl |
去污劑 | 2% TritonTM X-100，nonionic 2% TweenTM20，nonionic 2% NP-40，nonionic 2% Cholate，anionic 1% CHAPS，zwitterionic |
其他類 | 500 mM imidazole 20% ethanol 50% glycerol 100 mM Na2SO4 1.5 M NaCl 1 mM EDTA 60 mM citrate |
緩沖液 | 50 mM sodium phosphate，pH 7.4 100 mM Tris-HCl，pH 7.4 100 mM Tris-acetate，pH 7.4 100 mM HEPES，pH 7.4 100 mM MOPS，pH 7.4 100 mM sodium acetate，pH 7.4 |
附表4 問題及解決方案
問題 | 可能原因 | 推薦解決方案 |
柱子反壓過高 | 填料被堵塞 | 裂解液中可能含微小的固體顆粒，建議上柱前使用濾膜（0.22 µm或0.45 µm）過濾，或離心去除。 |
樣品中含高濃度的核酸，延長破碎時間直至粘度降低，或添加DNaseI （終濃度為5 µg/mL），Mg2+(終濃度1 mM)，冰上孵育10-15 min | ||
樣品太黏稠 | 有機試劑或蛋白穩定試劑（如甘油等）可能會引起反壓增高，降低操作流速。 | |
洗脫組分中無目的蛋白 | 蛋白可能是包涵體 | 可通過電泳檢測裂解液，分析上清中是否有目的蛋白，包涵體蛋白需按照包涵體蛋白的純化方式 |
表達量太低 | 優化表達條件，使用包涵體純化緩沖體系 | |
目的蛋白結合比較弱，在洗雜步驟中已被洗下來 | 提高Wash Buffer的pH值，或者降低咪唑濃度 | |
目的蛋白結合過強，不容易洗脫下來 | 降低Elution Buffer的pH，或者增加Elution Buffer中的咪唑濃度 | |
使用10-100 mM EDTA溶液剝離鎳離子，同時得到蛋白 | ||
蛋白降解 | 菌體破碎時需添加一些蛋白酶抑制劑 | |
在4℃下進行純化操作 | ||
洗脫組分不純（含多種蛋白） | 洗雜不* | 增加Wash Buffer 體積 |
樣品中含有其他His標簽蛋白 | 通過調節pH值或咪唑濃度來優化洗雜條件。再使用其他純化手段（如去離子交換，疏水等）進一步純化洗脫組分。 | |
填料顏色變淺或變成白色 | 鎳離子脫落或者剝離 | 按照填料再生的操作重新掛鎳離子 |
填料呈現褐色 | 緩沖液中含有DTT等還原劑 | 參考附3適當降低還原劑DTT的濃度，或改用巰基乙醇 |
上樣過程中蛋白發生沉淀 | 操作溫度太低 | 室溫下進行上樣 |
蛋白發生聚集 | 在樣品和所有緩沖液中添加穩定劑，如0.1%Triton X-100或Tween-20 |
相關產品
產品名稱 | 貨號 | 規格（mL） |
HisSep Ni-NTA Agarose Resin （His標簽蛋白瓊脂糖高速純化樹脂） | 20502ES10/50/60/80 | 10/50/100/1000 |
HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FF （His標簽蛋白瓊脂糖高速純化樹脂） | 20503ES10/50/60/80 | 10/50/100/1000 |
HisSep Ni-NTA 6FF Chromatography Column, 5mL （His標簽蛋白純化預裝柱，5 mL） | 20504ES08/25 | 5/5×5 |
HisSep Ni-NTA 6FF Chromatography Column, 1mL（His標簽蛋白純化預裝柱，1 mL） | 20505ES03/08 | 1/1×5 |
Anti-His Affinity Gel（Anti-His標簽親和純化凝膠） | 20589ES03/08/25/60 | 1/5/25/100 |
HB20220328
