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翌圣生物科技（上海）股份有限公司
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2024年，諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予了維克托·安布羅斯（Victor Ambros）和加里·魯夫昆（Gary Ruvkun）這兩位美國(guó)科學(xué)家，以表彰他們?cè)谖⑿NA（microRNA）及其在轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控中的關(guān)鍵作用方面的突破性發(fā)現(xiàn)。這一發(fā)現(xiàn)揭示了基因調(diào)控的新原理，并對(duì)生物體的發(fā)育和功能有著根本性的重要作用。
安布羅斯和魯夫昆的工作證明了microRNA在轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控中的作用，這是一種全新的基因調(diào)控機(jī)制。在此之前，科學(xué)界的焦點(diǎn)主要集中在轉(zhuǎn)錄因子如何作用于DNA，從而決定哪些mRNA被合成，進(jìn)而控制遺傳信息的傳遞。然而，這兩位科學(xué)家的發(fā)現(xiàn)刷新了我們對(duì)基因調(diào)控的理解，揭示了microRNA在調(diào)節(jié)基因表達(dá)中的重要性。研究顯示，人類(lèi)基因組中編碼了超過(guò)1000個(gè)的microRNA，這些microRNA在生物界中普遍存在，并在維持基因平衡和細(xì)胞功能方面發(fā)揮著重要的作用。
microRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度約為 22 個(gè)核苷酸的小型 RNA，大多數(shù) miRNA 來(lái)自非編碼 RNA 或內(nèi)含子，很少有與編碼基因外顯子重疊，保守的 miRNA (即在脊椎動(dòng)物中共享) 主要通過(guò)經(jīng)典的 miRNA 途徑生成，該途徑涉及兩個(gè) RNase III 酶：Drosha 和 Dicer。
Drosha 在細(xì)胞核中剪切 pri-miRNA 的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，釋放出前 miRNA (pre-miRNA)。
pre-miRNA 被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，由 Dicer 在末端環(huán)附近剪切，產(chǎn)生 miRNA 雙鏈。
成熟的 miRNA 一條鏈（miRNA*）被丟棄，另一條鏈（成熟 miRNA）與 Argonaute (Ago) 蛋白結(jié)合，并指導(dǎo) Ago 復(fù)合物沉默互補(bǔ)的 RNA 目標(biāo)。
除了經(jīng)典的 Drosha/Dicer 途徑，還存在一些非經(jīng)典的 miRNA 途徑，這些途徑不依賴(lài)于 Drosha 或 Dicer。例如：
mirtrons: 由內(nèi)含子剪接機(jī)制和內(nèi)含子去分支酶生成的 pre-miRNA 類(lèi)似物，從而繞過(guò) Drosha。
tRNA-miRNA: 通過(guò) RNase Z 的作用生成功能性 pre-miRNA。
5’-帽化的發(fā)夾結(jié)構(gòu): 由 RNA 聚合酶 II 轉(zhuǎn)錄，并帶有 5’ 帽子，然后由 XPO1 轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中。Dicer 只剪切帶有帽子的 pre-miRNA 的 3’ 臂，從而產(chǎn)生成熟的 miRNA。
圖.miRNA合成示意圖[1]
microRNA研究涉及多個(gè)層面，從發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證新的microRNA分子，到理解它們的功能和機(jī)制，再到可能的治療應(yīng)用。以下是一些microRNA研究中的常見(jiàn)問(wèn)題和相應(yīng)的解決方案：
發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證新的microRNA-如何從復(fù)雜的RNA樣本中鑒定出新的microRNA？
高通量測(cè)序：使用高通量測(cè)序技術(shù)（如RNA-seq）來(lái)鑒定新的microRNA分子。
生物信息學(xué)分析：利用專(zhuān)門(mén)的軟件工具對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，預(yù)測(cè)microRNA的序列和結(jié)構(gòu)。
實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：通過(guò)Northern blotting、RT-qPCR等方法驗(yàn)證預(yù)測(cè)的microRNA的存在和表達(dá)水平。
理解microRNA的功能-如何確定特定microRNA的功能？
功能喪失實(shí)驗(yàn)：通過(guò)敲減或敲除特定microRNA，觀察細(xì)胞或模型生物表型的變化。
靶基因預(yù)測(cè)：使用生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)microRNA的靶基因，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這些靶基因。
報(bào)告基因系統(tǒng)：使用含有microRNA反應(yīng)元件的報(bào)告基因系統(tǒng)來(lái)測(cè)試microRNA對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。
microRNA的機(jī)制研究-如何探究microRNA如何調(diào)控基因表達(dá)？
蛋白質(zhì)組學(xué)分析：使用質(zhì)譜等技術(shù)分析microRNA調(diào)控下的蛋白質(zhì)表達(dá)變化。
免疫共沉淀：研究microRNA與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）的相互作用。
細(xì)胞成像技術(shù)：利用熒光顯微鏡等觀察microRNA在細(xì)胞內(nèi)的分布和動(dòng)態(tài)。
microRNA在疾病中的作用-如何研究microRNA在疾病中的作用？
疾病模型：在動(dòng)物模型中研究特定microRNA的缺失或過(guò)表達(dá)對(duì)疾病進(jìn)展的影響。
臨床樣本分析：收集和分析疾病狀態(tài)下microRNA的表達(dá)譜，尋找潛在的生物標(biāo)志物。
藥物干預(yù)：開(kāi)發(fā)microRNA靶向藥物，如antagomirs、miRNA mimics等，用于治療研究。
microRNA的治療應(yīng)用-如何將microRNA研究轉(zhuǎn)化為臨床治療？
藥物設(shè)計(jì)：設(shè)計(jì)能夠特異性結(jié)合和抑制或激活特定microRNA的藥物。
臨床前研究：在細(xì)胞和動(dòng)物模型中測(cè)試藥物的安全性和有效性。
臨床試驗(yàn)：開(kāi)展臨床試驗(yàn)以評(píng)估m(xù)icroRNA靶向治療的安全性和療效。
產(chǎn)品推薦
目前定量分析miRNA的方法中最為常用的是熒光定量PCR。但是miRNA本身相對(duì)較小，傳統(tǒng)的RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和定量方法難以高效的保證miRNA的檢測(cè)，選對(duì)適配的方法此時(shí)則顯得尤為重要。
傳統(tǒng)的有機(jī)提取通常提取的是較大分子量的RNA，例如mRNA和核糖體RNA，但對(duì)于miRNA的提取效果則不太理想，可能是由于小分子量的miRNA不易被醇類(lèi)沉淀。針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，翌圣匠心研發(fā)了專(zhuān)門(mén)針對(duì)miRNA提取的產(chǎn)品-MolPure® Cell/Tissue miRNA Kit 細(xì)胞/組織miRNA提取試劑盒。
19331ES-MolPure® Cell/Tissue miRNA Kit 細(xì)胞/組織miRNA提取試劑盒
采用MolPure® RNA Column M1和microRNA Column M1以及新型的溶液體系，適用于從多種新鮮或凍存的動(dòng)物組織或培養(yǎng)細(xì)胞中快速提取各種小RNA。試劑盒內(nèi)的MolPure® RNA Column M1可選擇性吸附核酸，不吸附蛋白質(zhì)、多糖和其它非核酸類(lèi)物質(zhì)；microRNA Column M1則能從總RNA中有效富集到15-30 nt左右的小RNA（包括siRNA和miRNA）。
產(chǎn)品性能
成熟的miRNA的長(zhǎng)度只有20nt左右，通常正向引物就會(huì)覆蓋其全長(zhǎng)甚至?xí)卸嘤嗖糠郑聪蛞锞蜔o(wú)處安置了。目前市面上解決方案就是在反轉(zhuǎn)錄時(shí)設(shè)法增加反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長(zhǎng)度。常見(jiàn)的方法有加尾法和莖環(huán)法。
加尾法利用PolyA 聚合酶為成熟的miRNA加上Poly(A)尾，以帶有通用序列的Oligo-dT作為反轉(zhuǎn)錄引物，合成加長(zhǎng)的miRNA對(duì)應(yīng)cDNA第一鏈。莖環(huán)法以折疊為莖環(huán)結(jié)構(gòu)的通用序列作為引物合成加長(zhǎng)的miRNA對(duì)應(yīng)cDNA第一鏈，后續(xù)擴(kuò)增過(guò)程中，莖環(huán)結(jié)構(gòu)在適宜的溫度下會(huì)被打開(kāi)，和相關(guān)擴(kuò)增引物結(jié)合。
圖. 加尾法合成miRNA
圖.莖環(huán)法合成miRNA
類(lèi)別 | 加尾法 | 莖環(huán)法 |
適用性 | 適合于同時(shí)研究多種不同miRNA的情況 | 適合對(duì)樣本中少量幾個(gè)miRNA的精確定量檢測(cè) |
優(yōu)點(diǎn) | 一次反轉(zhuǎn)錄可檢測(cè)多個(gè)miRNA，通量高 | 一次反轉(zhuǎn)錄只能檢測(cè)一個(gè)miRNA，特異性強(qiáng) |
反轉(zhuǎn)錄體系 | 內(nèi)參與miRNA一起，在同一個(gè)反應(yīng)體系反轉(zhuǎn)錄，準(zhǔn)確性高 | 內(nèi)參與miRNA分開(kāi)，在兩個(gè)體系分別反轉(zhuǎn)錄，容易產(chǎn)生誤差 |
檢測(cè)特異性 | ★★★★☆ | ★★★★★ |
檢測(cè)靈敏度 | ★★★★★ | ★★★★☆ |
實(shí)驗(yàn)時(shí)間 | ★★★★☆ | ★★★★★ |
翌圣miRNA加尾法反轉(zhuǎn)定量組合（11148ES&11171ES)
11148ES-Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit
試劑盒采用加尾法來(lái)進(jìn)行miRNA第一鏈cDNA的反轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)品中的2×Hifair® miRNA RT buffer包含了miRNA加尾反應(yīng)和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的所有原料和引物，并經(jīng)過(guò)精心優(yōu)化，可保證miRNA 3‘末端的Poly(A)修飾過(guò)程和反轉(zhuǎn)錄過(guò)程同時(shí)高效進(jìn)行。
11171ES -Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix
專(zhuān)門(mén)為miRNA定量檢測(cè)而研發(fā)的新一代預(yù)混形式的熒光定量PCR檢測(cè)試劑，含有特殊的ROX Passive Reference Dye，適用于所有qPCR儀器，無(wú)需在不同的儀器上調(diào)整ROX的濃度，只需在配制反應(yīng)體系時(shí)加入引物和模板即可進(jìn)行擴(kuò)增。DNA 聚合酶采用化學(xué)修飾的熱啟動(dòng)聚合酶，配合特殊的Buffer體系，使反應(yīng)特異性更好，靈敏度更高，并能在更廣的范圍內(nèi)進(jìn)行準(zhǔn)確定量。
產(chǎn)品性能
圖. 以293T細(xì)胞的Total RNA為模板，用Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA稀釋10倍后，用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)分別檢測(cè)hsa-miR-let-7b-5p、hsa-miR-let-7c-5p、U6內(nèi)參基因。
圖. 以人工合成hsa-miR-let-7e-5p(a)和293T細(xì)胞Total RNA(b)為模板，分別稀釋成以下梯度：60拷貝到606拷貝（6個(gè)梯度）和10 pg-100 ng(5個(gè)梯度)，用Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)檢測(cè)hsa-miR-let-7e-5p基因表達(dá)情況。
圖. 人類(lèi)hsa-let-7家族擁有多條miRNA，彼此間相差的堿基很少，甚至只有單堿基的差異。每個(gè)Let-7亞型（hsa-miR-let-7a~Let-7i，has-miR-98）的人工合成miRNA使用 Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以不用的引物，用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)分別擴(kuò)增這些miRNA，利用公式2-ΔCT x 100%計(jì)算匹配率。結(jié)果顯示，可有效區(qū)分密切相關(guān)的亞型家族成員。
圖. 以人293T細(xì)胞和鼠源肝臟Total RNA為模板，擴(kuò)增miR-let-7b-5p、miR-let-7c-5p、miR-let-7e-5p、miR-let-7f-5p基因。結(jié)果顯示，與同類(lèi)產(chǎn)品相比，Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)配套 Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)的反應(yīng)體系，具有優(yōu)異的表現(xiàn)。
翌圣miRNA莖環(huán)法反轉(zhuǎn)定量組合（11139ES&11170ES)
11139ES-Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)
該試劑盒基于Hifair® III Reverse Transcriptase而開(kāi)發(fā)。該酶cDNA合成速度快，且熱穩(wěn)定性大幅度提高，可耐受高達(dá)60℃的反應(yīng)溫度，適合具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA模板的反轉(zhuǎn)錄。同時(shí)，該酶增強(qiáng)了與模板的親和力，適合少量模板以及低拷貝基因的反轉(zhuǎn)錄。Hifair® III Reverse Transcriptase合成全長(zhǎng)cDNA的能力也有了提升，可合成長(zhǎng)達(dá)19.8 kb的cDNA。
11170ES-Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix
本產(chǎn)品是使用SYBR Green I嵌合熒光法進(jìn)行miRNA定量反應(yīng)的專(zhuān)用預(yù)混液。由于miRNA序列短，且同一家族的miRNA序列往往高度相近，故在定量時(shí)對(duì)特異性要求高。本品基于熱啟動(dòng)的 DNA 聚合酶，配以?xún)?yōu)化的Buffer，能夠極大地減少非特異性擴(kuò)增；同時(shí)，特殊的ROX Reference Dye，使得預(yù)混液適應(yīng)于所有qPCR儀器，無(wú)需在不同的儀器上調(diào)整ROX濃度，只需在配制反應(yīng)體系時(shí)加入引物和模板即可進(jìn)行擴(kuò)增。
圖.以小鼠肝臟細(xì)胞的Total RNA為模板，用Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)（Cat# 11139ES）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA稀釋40倍后，用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（Cat# 11170ES）分別擴(kuò)增人源的mmu-miR-125a基因。
圖.以小鼠肝臟細(xì)胞的Total RNA為模板，用Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)（Cat# 11139ES）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA 以10倍梯度稀釋?zhuān)ǚ秶?0pg /μL-0.1μg /μL），擴(kuò)增鼠源的mmu-miR-125a、mmu-miR-132、mmu-miR-351基因。
圖. 人類(lèi)hsa-let-7家族擁有多條miRNA，彼此間相差的堿基很少，甚至只有單堿基的差異。以不同的引物，使用 Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（Cat# 11170ES）分別擴(kuò)增這些miRNA，利用公式2^-△ct x 100%計(jì)算匹配率。
圖.以人293T細(xì)胞的Total RNA為模板反轉(zhuǎn)錄，用Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)（Cat# 11139ES）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA稀釋50倍，使用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（Cat# 11170ES）進(jìn)行90孔平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增人源的hsa-let-7a基因。
相關(guān)產(chǎn)品列表
方法類(lèi)型 | 實(shí)驗(yàn)步驟 | 產(chǎn)品名稱(chēng) | 產(chǎn)品貨號(hào) |
miRNA轉(zhuǎn)染 | 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 | Hieff Trans® in vitro siRNA/miRNA Transfection Reagent | 40806ES |
miRNA提取 | 核酸提取 | MolPure® Cell/Tissue miRNA Kit | 19331ES |
MolPure® Serum/Plasma miRNA Kit | 19332ES | ||
加尾法反轉(zhuǎn)定量 | 反轉(zhuǎn)錄 | Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit | 11148ES |
定量PCR | Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix | 11171ES | |
莖環(huán)法反轉(zhuǎn)定量 | 反轉(zhuǎn)錄 | Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus) | 11139ES |
定量PCR | Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix | 11170ES |
[1] Shang R, Lee S, Senavirathne G, Lai EC. microRNAs in action: biogenesis, function and regulation. Nat Rev Genet. 2023;24(12):816-833. doi:10.1038/s41576-023-00611-y
