DSY5000X熒光顯微鏡

DSY5000X熒光顯微鏡

第五節  熒光顯微鏡（Fluorescence microscope）

熒光顯微鏡是用人眼不可見的一定波長的紫外線作光源照射被檢物體，使之受激發后而產生人眼可見的熒光，然后再經顯微鏡成象系統放大來進行鏡檢。熒光顯微術是生物、醫學中的重要研究工具，如對生物組織、生理、病理、微生物、醫藥、食品、化學等諸方面的鑒定等。

一、基本原理

    （一）熒光：普通光是由發光體質點的熱運動所引起的幅射；而熒光是非溫度幅射，是一種冷光。熒光有多種，如光化熒光（由光源激發而產生的熒光）、放射熒光（由放射性物質激發而產生的熒光）、生物熒光（生物體發出的熒光）、化學熒光（如磷的氧化時發出的熒光）等等。而熒光顯微鏡則是利用“光化熒光”這一原理設計制造，達到熒光顯微術鏡檢的目的。

由于熒光顯微鏡的光源是利用人眼不可見的短波光——紫外線，因而就大為提高了物鏡的分辨率，圖象與背景的反差亦甚為明顯。

（二）熒光現象：將熒光物體放到光譜中的各色區域，就可艱現引起熒光有效的光線是光譜上波長較短的區域，即近紫外線區域，波長約0.32~0.40um。這種現象的實質是分子吸收了短波光的能量（波長越短，光能越強），又以發光的形式以波長較長的熒光射出，而為人眼可見，這就是“熒光現象”。熒光接近可見光的紅端，大部分的熒光現象是符合這一規律的。熒光現象可分為兩種：

1）一次熒光現象：又稱“固有熒光”或“自發熒光”，當經紫外線的照射后，就能發出熒光的物質而謂之；

2）第二次熒光現象：又稱“繼發熒光“，當經紫外線照射后不能或只部分發生微弱的熒光，這樣就需先用熒光素處理，再經紫外線照射才能發生熒光，這是因組織內吸附或溶解有熒光素的緣故。

熒光色素的種類甚多，大部分為制片技術中所用的染色劑，對各種被檢物體表現出不同的親和性。因此，對熒光色素的選擇、應用濃度及處理時間等諸方面都需摸索和積累經驗。

二、熒光顯微鏡的裝置

   熒光顯微鏡在裝置上的重要部件就是要有能提供充分的特定波長的光源裝置，使被檢物體得到理想的激發而發出強的熒光。為達到這一要求，均借助濾光片把激發的光譜限定在這一特定的波長區域內，而把伴隨發出的可見光全部吸收或反射掉。此外，為了提高熒光鏡檢的效果，對聚光鏡（透射式用）、載玻片、蓋玻片和物鏡均有一定的要求。

   熒光顯微鏡的裝置有透射擊式和落射式兩種類型。

   （一）透射式：激發光來自被檢物體的下方，聚光鏡為暗場聚光鏡，使激發光不進入物鏡，而使熒光進入物鏡。它在低倍情況下明亮，而高倍則暗，在油浸和調中時，較難操作，尤以低倍的照明范圍難于確定，但能得到很暗的視場背景。透射式不適用于非透明的被檢物體。

   （二）落射工：新型 的熒光顯微鏡多為落射式，在光路中具有分光鏡，光源來自被檢物體的上方，故對透明與非透明的被檢物體都適用。由于物鏡起到了聚光鏡的作用，不僅便于操作，而且從低倍到高倍可以實現整個視場的均勻照明，但它在低倍情況下則暗，而高倍則明。

    三、激發濾色鏡的選擇與熒光色至少的應用

   生物體的各種組織、不同的細胞、細胞器、微生物、病毒等等，對激發光的選擇是很重要的，這可利用不同的激發濾色鏡來達到佳的激發光源。在熒光色素的應用上也如此，必須應用適合某種被檢物體的熒光素，才以獲得滿意的觀察效果。現將一些應用實例列表于下，僅供參考：

注：U激發-紫外激發   V激發-紫色激發  B激發-藍色激發  G激發-綠色激發

   3）蛋白粘貼劑不能用以熒光色素處理的材料，因蛋白能為熒光色素染色，而發生附加熒光。

   4）如為石蠟制片，脫蠟必須*，因石蠟有青色熒光，切片進入水后，應充分水洗，再經熒光色素處理，用水封固進行鏡檢。

   5）載玻片、蓋玻片好為螢石玻璃制成，如為普通玻璃，要色澤潔白，厚度要符合標準。同是不能有灰塵及有機物質否則將會發生熒光而干擾政黨的鏡檢效果。

   6）不能用加拿大樹膠作封固劑，因其本身具有青黃色熒光，可用甘油、甘油膠、糖漿及阿拉伯樹膠封固。