天凈沙211216-100可調式易錯 PCR 試劑盒

北京天凈沙基因科技有限公司，是一家聚焦科研試劑、動物檢驗檢疫、分子診斷的研發和生產企業。

211216-100 天凈沙 可調式易錯 PCR 試劑盒，產品簡介：

產品品牌：天凈沙

產品名稱：可調式易錯 PCR 試劑盒

產品貨號：211216-100

產品規格：100次

211216-100 天凈沙 可調式易錯 PCR 試劑盒

產品及特點

易錯PCR（Error-prone PCR）是利用Taq DNA多聚酶不具有3′→5′校對功能的特性，在一定條件下（如不同的dNTP濃度、Mg濃度和MnCl2存在）能夠按較高的機率引入隨機引入突變。如果有適當的選擇方法，則可從構建的突變庫選出所需突變體。本產品是在本公司的易錯PCR試劑盒的基礎上改進而得，本

產品具有下列特點：

1. 即開即用，十分簡單方便，尤其在生物制藥和酶學研究領域顯示出了它的*性。

2. 配方經過精心優化，實驗人員在一定范圍內可以控制突變率，一輪PCR的突變率范圍在2-8突變/1000bp，更高的突變率可以通過多輪PCR達到。

3. 可用于連續易錯PCR（sequential error-prone PCR），只需把上一次易錯PCR的產物用作下一次易錯PCR的模板即可，使每一次獲得的小突變累積而產生重要的有益突變。

4. 可以擴增的DNA片段更長，達到2kb，對于2kb以上的產物，建議分段擴增。

5. 本試劑盒足夠100次30uL體系的易錯PCR。

6. 本產品只能用于科研。

規格及成分

本產品采用五孔盒包裝

運輸及保存

低溫運輸，-20℃保存, 有效期為一年

自備試劑

引物、DNA模板、常規PCR試劑盒

使用方法

1. 將引物稀釋到10uM。引物也是決定易錯PCR成敗的關鍵因素，設計引物時要保證其Tm在70℃，長度在25-30nt之間，GC含量在45%-60%之間，3端GC含量低，并且沒有發夾結構。

2. 用自備易錯PCR引物和自備的常規PCR試劑擴增制備易錯DNA模板（常規PCR產物），膠回收并準確確定濃度。注意：易錯PCR的模板一定要用膠回收的常規PCR產物，因為膠回收會可以把電泳不可見的非特異性擴增片段去除，否則這些片段由于也是用易錯PCR引物擴增所得，在易錯PCR擴增時也會被擴增，產生競爭抑制，降低靶分子的擴增效率。

3. 將回收的DNA片段（模板）稀釋到1ng/uL 、10ng/uL和100ng/uL三個濃度。注意：模板使用量是影響突變率的最重要因素，模板DNA為非突變DNA，擴增產生的DNA為突變DNA，易錯PCR體系最終DNA量是基本固定的，因此模板DNA使用量越大，則突變DNA在終產物中的相對比例就越低，突變率就越低。故建議同時測試三個模板用量。如果都成功，則優先選用模板濃度低的PCR產物進行分析。

4. 根據每1000bp的預期突變數按下表確定30uL易錯PCR體系中MnCl₂和dGTP的用量（這是在模板DNA不超過1ng的前提下的數據）。表中的Mn表示可調易錯PCR專用的MnCl₂, dG表示可調易錯PCR專用的dGTP：

5. 設置30uL體系的可調易錯PCR：第一次建議設置3個模板濃度。在3干凈的PCR管中，分別加入下列成分。最后加可調易錯PCR專用MnCl₂

6. 按已經優化的常規PCR條件進行易錯PCR：

注：由于易錯PCR含高濃度的鎂離子，因此容易形成引物二聚體，因此需要使用較高的復性溫度，以避免小片段擴增產物競爭性抑制PCR。易錯PCR一般不需要熱啟動，也不需要在易錯PCR結束后做延伸處理。易錯PCR循環次數越多，突變DNA（擴增產物）與非突變DNA（原始模板）的比例就越高。此外在突變率和模板長度恒定的情況下，擴增次數越多，發生突變的絕對數就越高，在同一模板上發生的突變位點數就越多，所以如果需要，可以做30、35、40、45、50、55、60次7個循環數的比較

7. 易錯PCR結束后，取3uL進行電泳檢查。

8. 如果有預期大小的PCR產物，則全部電泳，進行膠回收，再進行克隆和測序等后續操作。如果需要增加突變率，可以選擇一個突變后的DNA為模板，再進行下一輪易錯PCR。

9. 如果沒有預期大小的PCR產物，可以按下列操作追加進行一輪常規PCR（追加PCR）。

10. 在PCR管中，加入3uL 10×可調易錯PCR專用追加dNTP到27uL電泳剩下的PCR體系中，按下表進行追加PCR（chasing PCR）。注意追加PCR只做20次循環。

11. 追加PCR結束后，再電泳檢測。如果有條帶，再進行克隆和測序等后續操作。如果需要增加突變率，可以選擇一個突變后的DNA為模板，再進行下一輪易錯PCR。

12. 如果沒有預期大小的PCR產物，則需要分析原因

疑難解答

Q：現象：沒有PCR產物。

A：可能原因：一是引物沒有優化，可以重新設計引物；二是模板DNA太少，可以增加用量；三是模板不純，最好先膠回收；四是DNA溶液中有EDTA，可以適當補加Mg++。

Q：現象：太多的PCR條帶或PCR條帶模糊一片。

A：可能原因：一是模板有膠回收、二是PCR循環數太多；三是復性溫度太低；四是引物沒有優化；五是PCR條件沒優化，可以使用touch-down PCR。

Q: 如果需要更高的突變率，如何辦？

A: 可以使用連續多次易錯PCR來提高突變率。但最好先用膠純化回收易錯PCR片段,再用于下一輪易錯PCR。

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