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平端DNA連接的優(yōu)缺點(diǎn)、要求條件、實(shí)驗(yàn)步驟和注意事項(xiàng)
點(diǎn)擊次數(shù):5592 發(fā)布時(shí)間:2016-8-4
T4噬菌體dna連接酶不同于大腸桿菌DNA連接酶,它可以催化平端DNA片段的連接(Sgaramella和 Khorana,1972;Sgaramella和Ehrlich,1978),由于DNA很容易成為平端,所以這是一個(gè)極為有用的酶學(xué)物性。有了這樣的物性,才能使任何DNA分子彼此相連。
優(yōu)點(diǎn):
1、沒(méi)有連不上的,只有切不開(kāi)的。平末端連接不牽扯到粘性末端的堿基突出問(wèn)題,所以,理論上任何兩條DNA序列都能連接在一起,當(dāng)然需要 ligase的酶學(xué)作用。這個(gè)不同DNA分子之間的連接帶來(lái)了極大地便利,因?yàn)槠侥┒俗匀皇沁@樣,而如果遇到5‘或者3’突出的粘性末端,也可以經(jīng)過(guò)處理成為平末端。
2、有時(shí)候,兩個(gè)平末端連接在一起以后,可以產(chǎn)生另一種內(nèi)切酶的識(shí)別序列,為后續(xù)的克隆工作提供了一種機(jī)會(huì)。
缺點(diǎn):
1、連接效率比粘性末端低:連接效率之所以比較低,原因之一是在連接過(guò)程中只有連接酶的作用,缺乏粘性末端那樣突出堿基的互補(bǔ)作用;原因之二是常用的T4DNAligase對(duì)于平末端的Km值比粘性末端高1000倍。
2、可能產(chǎn)生雙向插入:由于平端連接的末端沒(méi)有特異性,連接的時(shí)候不能定向,所以兩種方向的插入都有可能。這個(gè)時(shí)候就需要有一種有效的鑒定方法。一般分別在載體和目的片段選擇一個(gè)酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切鑒定,當(dāng)然,具體的鑒定方法要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)而定。
3、可能多拷貝插入:平端連接時(shí),可能目的片段多個(gè)插入,并且在多個(gè)插入的時(shí)候還有可能每個(gè)插入子以不同方向連接,導(dǎo)致有時(shí)候結(jié)果難以解釋。一般目的片段越大,多拷貝插入的可能就越小。
平端連接要求的條件:
1、低濃度(0.5mmol/L)的atp(Ferretti和Sgaranekka,1981)。
2、不存在亞精胺一類的多胺。
3、*濃度的連接酶(50Weiss單位.ml)。
4、高濃度的平端。
實(shí)驗(yàn)試劑:
凝聚劑:在反應(yīng)混合物中加入一些可促進(jìn)大分子群聚作用并可導(dǎo)致DNA分子凝聚成集體的物質(zhì),如聚乙二醇(Pheiffer和 Zimmerman,1983;Zimmerman和Pheiffer,1983;ZimmermanT Harrison,1985)或氯化六氨全高鈷(Rusche和Howard-Flanders,1985),可以使如何取得適當(dāng)濃度的平端DNA的總是迎刃而解。在連接反應(yīng)中,這些物質(zhì)具有兩作用:
1、它們可使平端DNA的連接速率加大1-3個(gè)數(shù)量級(jí),因此可使連接反應(yīng)在酶DNA濃度不高的條件下進(jìn)行。
2、它們可以改變連接產(chǎn)物的分布,分子內(nèi)連接受到抑制,所形成的連接產(chǎn)物一律是分子間連接的產(chǎn)物。這樣,即使在有利于自身環(huán)化(j:i=10)的DNA濃度下,所有的DNA產(chǎn)物也將是線狀多聚體。
聚乙二醇(PEG8000):
1、用去離子水配制PEG8000貯存液(40%)分裝成小份,冰凍保存,但加入連接反應(yīng)混合物之前應(yīng)將其融化并使其達(dá)到室溫。在含15%PEG 8000的連接反應(yīng)混合物中,對(duì)連接反刺激效應(yīng)zui為顯著。除PEG 800和T4噬菌體DNA連接酶以外,其他所有連接混合物的組分應(yīng)于0℃混合,然后加適當(dāng)體積的PEG 8000(處于室溫),混勻,加酶后于20℃進(jìn)行溫育。
2、連接混合物中含0.5mmol/L ATP和5mmol/L MgCl2時(shí)對(duì)連接反應(yīng)的刺激效應(yīng)zui為顯著,甚至ATP濃度略有增加或MgCl2濃度略有降低,都會(huì)嚴(yán)重降低刺激的強(qiáng)度(Pheiffer和Zimmerman,1983)。
3、濃度為15%的PEG 8000可刺激帶粘端的DNA分子的連接效率提高至原來(lái)的10-100倍,反應(yīng)的主產(chǎn)物是串聯(lián)的多聯(lián)體。
4、PEG 8000可刺激短至8個(gè)核苷酸的合成寡聚物的平端連接,在這一方面,它與氯化六氨合高鈷有所不同。
氯化六氨合高鈷:
1、氯化六氨合高鈷可用水配成10mmol/L貯存液貯存于-20℃,它對(duì)連接反應(yīng)的刺激具有高度的濃度信賴性。當(dāng)連接反應(yīng)混合物中鹽深度為 1.0-1.5μmol/L時(shí),其刺激作用zui大。氯化六氨合高鈷可使平端連接的效率大約提高到原來(lái)的50W部,但只能使端連接的效率提高到原來(lái)的5倍(Rusche和Howard-Flanders,1985)。
2、在單價(jià)陽(yáng)離子(30mmol/L KCl)存在下,它對(duì)平端連接仍有一定的刺激作用,但此時(shí)連接產(chǎn)物的分布有所改變。連接產(chǎn)物不再是清一色的分子間連接產(chǎn)物,相反,環(huán)狀DNA將點(diǎn)盡優(yōu)勢(shì)。
3、與PEG8000不同,氯化六氨合高鈷不能顯著提高合成寡核苷酸的連接速率。
實(shí)驗(yàn)步驟:
(以20μl 酶切完后的體系為例)
1、如果要補(bǔ)平或切平,先將樣品置于70度水浴10min,將體系放大到50μl,其中按照說(shuō)明書(shū)加入所需klenow buffer和酶,以及BSA等。
2、常溫反應(yīng)10min后將反應(yīng)物置于37度水浴,再加入T4聚合酶,反應(yīng)5min。
3、凝膠回收處理的載體或片斷。
4、CIAP處理。
5、苯酚氯仿純化,zui后乙醇回收。
6、連接反應(yīng)。
注意事項(xiàng):
1、插入片斷和載體片斷的比例要高。
2、連接酶要加的多點(diǎn),用高濃度的酶。
3、載體片斷要做去磷酸化處理。
4、也可以用15%的PEG8000來(lái)增加連接效率和減少載體自聯(lián)。
5、反應(yīng)體系10μl,不要太大。
6、載體片斷不要加多了,一般酶切跑