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平端DNA連接的優缺點、要求條件、實驗步驟和注意事項
點擊次數:5601 發布時間:2016-8-4
T4噬菌體dna連接酶不同于大腸桿菌DNA連接酶,它可以催化平端DNA片段的連接(Sgaramella和 Khorana,1972;Sgaramella和Ehrlich,1978),由于DNA很容易成為平端,所以這是一個極為有用的酶學物性。有了這樣的物性,才能使任何DNA分子彼此相連。
優點:
1、沒有連不上的,只有切不開的。平末端連接不牽扯到粘性末端的堿基突出問題,所以,理論上任何兩條DNA序列都能連接在一起,當然需要 ligase的酶學作用。這個不同DNA分子之間的連接帶來了極大地便利,因為平末端自然是這樣,而如果遇到5‘或者3’突出的粘性末端,也可以經過處理成為平末端。
2、有時候,兩個平末端連接在一起以后,可以產生另一種內切酶的識別序列,為后續的克隆工作提供了一種機會。
缺點:
1、連接效率比粘性末端低:連接效率之所以比較低,原因之一是在連接過程中只有連接酶的作用,缺乏粘性末端那樣突出堿基的互補作用;原因之二是常用的T4DNAligase對于平末端的Km值比粘性末端高1000倍。
2、可能產生雙向插入:由于平端連接的末端沒有特異性,連接的時候不能定向,所以兩種方向的插入都有可能。這個時候就需要有一種有效的鑒定方法。一般分別在載體和目的片段選擇一個酶切位點進行酶切鑒定,當然,具體的鑒定方法要根據具體的實驗而定。
3、可能多拷貝插入:平端連接時,可能目的片段多個插入,并且在多個插入的時候還有可能每個插入子以不同方向連接,導致有時候結果難以解釋。一般目的片段越大,多拷貝插入的可能就越小。
平端連接要求的條件:
1、低濃度(0.5mmol/L)的atp(Ferretti和Sgaranekka,1981)。
2、不存在亞精胺一類的多胺。
3、*濃度的連接酶(50Weiss單位.ml)。
4、高濃度的平端。
實驗試劑:
凝聚劑:在反應混合物中加入一些可促進大分子群聚作用并可導致DNA分子凝聚成集體的物質,如聚乙二醇(Pheiffer和 Zimmerman,1983;Zimmerman和Pheiffer,1983;ZimmermanT Harrison,1985)或氯化六氨全高鈷(Rusche和Howard-Flanders,1985),可以使如何取得適當濃度的平端DNA的總是迎刃而解。在連接反應中,這些物質具有兩作用:
1、它們可使平端DNA的連接速率加大1-3個數量級,因此可使連接反應在酶DNA濃度不高的條件下進行。
2、它們可以改變連接產物的分布,分子內連接受到抑制,所形成的連接產物一律是分子間連接的產物。這樣,即使在有利于自身環化(j:i=10)的DNA濃度下,所有的DNA產物也將是線狀多聚體。
聚乙二醇(PEG8000):
1、用去離子水配制PEG8000貯存液(40%)分裝成小份,冰凍保存,但加入連接反應混合物之前應將其融化并使其達到室溫。在含15%PEG 8000的連接反應混合物中,對連接反刺激效應zui為顯著。除PEG 800和T4噬菌體DNA連接酶以外,其他所有連接混合物的組分應于0℃混合,然后加適當體積的PEG 8000(處于室溫),混勻,加酶后于20℃進行溫育。
2、連接混合物中含0.5mmol/L ATP和5mmol/L MgCl2時對連接反應的刺激效應zui為顯著,甚至ATP濃度略有增加或MgCl2濃度略有降低,都會嚴重降低刺激的強度(Pheiffer和Zimmerman,1983)。
3、濃度為15%的PEG 8000可刺激帶粘端的DNA分子的連接效率提高至原來的10-100倍,反應的主產物是串聯的多聯體。
4、PEG 8000可刺激短至8個核苷酸的合成寡聚物的平端連接,在這一方面,它與氯化六氨合高鈷有所不同。
氯化六氨合高鈷:
1、氯化六氨合高鈷可用水配成10mmol/L貯存液貯存于-20℃,它對連接反應的刺激具有高度的濃度信賴性。當連接反應混合物中鹽深度為 1.0-1.5μmol/L時,其刺激作用zui大。氯化六氨合高鈷可使平端連接的效率大約提高到原來的50W部,但只能使端連接的效率提高到原來的5倍(Rusche和Howard-Flanders,1985)。
2、在單價陽離子(30mmol/L KCl)存在下,它對平端連接仍有一定的刺激作用,但此時連接產物的分布有所改變。連接產物不再是清一色的分子間連接產物,相反,環狀DNA將點盡優勢。
3、與PEG8000不同,氯化六氨合高鈷不能顯著提高合成寡核苷酸的連接速率。
實驗步驟:
(以20μl 酶切完后的體系為例)
1、如果要補平或切平,先將樣品置于70度水浴10min,將體系放大到50μl,其中按照說明書加入所需klenow buffer和酶,以及BSA等。
2、常溫反應10min后將反應物置于37度水浴,再加入T4聚合酶,反應5min。
3、凝膠回收處理的載體或片斷。
4、CIAP處理。
5、苯酚氯仿純化,zui后乙醇回收。
6、連接反應。
注意事項:
1、插入片斷和載體片斷的比例要高。
2、連接酶要加的多點,用高濃度的酶。
3、載體片斷要做去磷酸化處理。
4、也可以用15%的PEG8000來增加連接效率和減少載體自聯。
5、反應體系10μl,不要太大。
6、載體片斷不要加多了,一般酶切跑