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RNA一度被認(rèn)為僅僅是DNA和蛋白質(zhì)之間的“過渡”，但越來越多的證據(jù)清楚的表明，RNA在生命的進(jìn)程中扮演的角色遠(yuǎn)比我們早前設(shè)想的更為重要。RNA 干擾(RNA interference)的發(fā)現(xiàn)使得人們對RNA調(diào)控基因表達(dá)的功能有了全新的認(rèn)識，更因?yàn)榭梢院喕?替代基因敲除而成為研究基因功能的有力工具，因此格外引人注意，在2002年度Science評選的*科學(xué)成就中RNAi名列。隨著對小分子RNA研究的不斷深入，研究人員開始認(rèn)識到：小分子 RNA的世界一點(diǎn)都不小。有人推測：小分子RNA可能代表發(fā)現(xiàn)了一個新層次上的基因表達(dá)調(diào)控方式。生物通早在去年底到今年初已經(jīng)有很多文章介紹有關(guān) siRNAs以及其在RNA干擾中的作用以及研究應(yīng)用方法，在這里生物通繼續(xù)為我們的用戶介紹另一種越來越引人注目的小分子RNA——micrornA。

什么是miRNA

MicroRNAs (miRNAs)是一種大小約21—23個堿基的單鏈小分子RNA，是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成，不同于sirna(雙鏈)但是和siRNA密切相關(guān)。據(jù)推測，這些非編碼小分子RNA(miRNAs)參與調(diào)控基因表達(dá)，但其機(jī)制區(qū)別于siRNA介導(dǎo)的mRNA降解。*個被確認(rèn)的miRNA是在線蟲中發(fā)現(xiàn)的lin-4 和let-7，隨后多個研究小組在包括人類、果蠅、植物等多種生物物種中鑒別出數(shù)百個miRNAs。

miRNA 的特征

已經(jīng)被鑒定的miRNAs據(jù)推測大都是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)、約70個堿基大小形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈RNA前體經(jīng)過DICEr酶加工后生成的，有5’端磷酸基和 3’羥基，大小約21—25nt的小分子RNA片斷，定位于RNA前體的3’端或者5’端。

zui近3個研究小組分別從線蟲、果蠅和Hela細(xì)胞中鑒定的100個新miRNAs中，有15%跨越線蟲、果蠅和哺乳動物基因組具有高度的保守性(只有有1—2個堿基的區(qū)別)，Lau 和Bar 實(shí)驗(yàn)室的同事更加認(rèn)為：所有的miRNAs可能在其他物種中具有直向同源物(Ortholog，指那些起源于同一祖先，在不同生物體中行使同一功能的基因群就可比作為一個門類，這些類似的基因被稱為“直向同源物”)。

Bantam zui早被認(rèn)為是果蠅中參與細(xì)胞增殖的一個基因位點(diǎn)。已知幾個包含增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)座子插入跨越這個位點(diǎn)的一段12.3kb區(qū)域會導(dǎo)致果蠅的眼和翅重復(fù)生長，而由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的一段跨越該位點(diǎn)的23kb片斷缺失則導(dǎo)致突變果蠅個體小于野生型果蠅。Cohen和同事用一段3.85kb的片斷導(dǎo)入21kb片斷缺失的果蠅中使其恢復(fù)原來的大小。但是奇怪的是表達(dá)這個3.85kb片斷中的EST卻沒有同樣的效果。Cohen將這個片斷和瘧蚊Anopheles gambiae的同源序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)一段90bp的高度保守區(qū)，經(jīng)過RNA folding program (mfold)發(fā)現(xiàn)這個保守序列可以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使得這個區(qū)段很象是一個miRNA的前體。這個結(jié)果經(jīng)過Northern blot證實(shí)突變果蠅的幼體缺少一個21bp的bantam miRNA ，用這個90bp的mRNA前體經(jīng)過一系列的“功能缺失”—“功能恢復(fù)”實(shí)驗(yàn)，證實(shí) bantam miRNA在細(xì)胞增殖中的作用。研究人員用計(jì)算機(jī)程序檢索在hid mRNA的3’非編碼區(qū)找到了bantam的3個潛在的結(jié)合位點(diǎn)( hid是果蠅中一個誘導(dǎo)凋亡的基因)，并證實(shí) bantam miRNA抑制hid 的翻譯而非轉(zhuǎn)錄。

miRNAs的表達(dá)方式各不相同。部分線蟲和果蠅的miRNA在各個發(fā)育階段的全部細(xì)胞中都有表達(dá)，而其他的miRNA則依據(jù)某種更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)奈幌嗪蜁r相的表達(dá)模式(a more restricted spatial and temporal expression pattern)——在不同組織、不同發(fā)育階段中miRNA的水平有顯著差異。

miRNA的功能

對microRNAs (miRNAs)的研究正在不斷增加，原因是科學(xué)家開始認(rèn)識到這些普遍存在的小分子在真核基因表達(dá)調(diào)控中有著廣泛的作用。在線蟲，果蠅，小鼠和人等物種中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的數(shù)百個miRNAs中的多數(shù)具有和其他參與調(diào)控基因表達(dá)的分子一樣的特征——在不同組織、不同發(fā)育階段中miRNA的水平有顯著差異，這種 miRNAs表達(dá)模式具有分化的位相性和時序性( differential spatial and temporal expression patterns)，提示miRNAs有可能作為參與調(diào)控基因表達(dá)的分子，因而具有重要意義。

*個被確認(rèn)的miRNA——在線蟲中發(fā)現(xiàn)的lin-4 和let-7，可以通過部分互補(bǔ)結(jié)合到目的mRNA靶的3’非編碼區(qū)(3’UTRs)，以一種未知方式誘發(fā)蛋白質(zhì)翻譯抑制，進(jìn)而抑制蛋白質(zhì)合成，通過調(diào)控一組關(guān)鍵mRNAs的翻譯從而調(diào)控線蟲發(fā)育進(jìn)程(reviewed in Pasquinelli 2002)。

bantam miRNA是*個被發(fā)現(xiàn)有原癌基因作用的miRNA。除了lin-4、let-7，已知還有一些miRNAs可能參與在細(xì)胞分化和組織發(fā)育過程中起重要作用的基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，例如mir-14、mir-23 等。

在植物miRNAs的研究中有兩條線索提示miRNAs可能參與植物的發(fā)育過程。一是在carpel factory (car) 突變株中3個miRNAs的表達(dá)水平顯著下降。CARPEL FACTORY 是一個類似Dicer的酶，參與植物的發(fā)育，其缺失突變株表現(xiàn)為胚胎和葉片發(fā)育的缺陷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示這種缺陷是由于缺少miRNAs加工而造成的。多數(shù)的植物miRNAs在某些特定組織中高水平表達(dá)也提示他們可能參與了植物組織的發(fā)育。

對一部分miRNAs的研究分析提示：miRNAs參與生命過程中一系列的重要進(jìn)程，包括早期發(fā)育(Reinhart 2000)，細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡，細(xì)胞死亡(Brennecke 2003)，脂肪代謝(Xu 2003)和細(xì)胞分化(Kawasaki 2003)。此外，一個研究表明，2個miRNAs水平的下降和慢性淋巴細(xì)胞白血病之間的顯著相關(guān)，提示miRNAs和癌癥之間可能有潛在的關(guān)系 (Calin 2002)。

由于miRNAs存在的廣泛性和多樣性，提示miRNAs可能有非常廣泛多樣的生物功能。盡管對miRNA的研究還處于初級階段，據(jù)推測miRNAs在真核生物體內(nèi)對基因表達(dá)的調(diào)控作用可能和轉(zhuǎn)錄因子一樣重要。有一種看法是：miRNAs可能代表在一個新發(fā)現(xiàn)的層次上的基因表達(dá)調(diào)控方式。

然而，大多數(shù)miRNAs的功能仍然是個謎。

miRNA的作用方式

zui早被發(fā)現(xiàn)的兩個miRNAs——lin-4 and let-7被認(rèn)為是通過不*互補(bǔ)結(jié)合到目標(biāo)靶mRNA 3’非編碼區(qū)端，以一種未知方式誘發(fā)蛋白質(zhì)翻譯抑制，進(jìn)而抑制蛋白質(zhì)合成，阻斷mRNA的翻譯。多個果蠅miRNAs也被發(fā)現(xiàn)和他們的目標(biāo)靶mRNAs的 3’非編碼區(qū)有部分同源。由于miRNAs和其潛在的目標(biāo)靶之間并非*互補(bǔ)，這使得通過信息學(xué)的方法鑒定miRNA的目標(biāo)靶位點(diǎn)變得困難。因而也無法確定miRNAs的作用方式是什么，以何種機(jī)制影響mRNA的翻譯，以何種方式調(diào)控基因表達(dá)。miRNAs的作用目標(biāo)靶和活性機(jī)制一直是各地的研究人員的關(guān)注熱點(diǎn)。

在植物中目前有一個miRNA和3個潛在的目標(biāo)靶基因*互補(bǔ)(這些scarecrow 基因編碼潛在的轉(zhuǎn)錄因子)，盡管目前還不清楚這些基因是否就是miRNA的目標(biāo)靶，這仍是*次發(fā)現(xiàn)miRNA 和其潛在的目標(biāo)靶*互補(bǔ)，也提示miRNA可能包含和siRNA類似的作用方式。

識別 miRNAs的方法

多個研究小組采用生物化學(xué)結(jié)合是生物信息學(xué)的方法開展對miRNAs的研究工作。由于據(jù)推測都是由Dicer酶降解RNA得到的，21—23個堿基大小、有5’端磷酸基和3’羥基的RNA片斷，有的實(shí)驗(yàn)室采用改良的定向克隆方法來篩選具有相同特征的小分子——篩選一定大小的RNA分子，連接到3’和5’的適配子(adapters)，逆轉(zhuǎn)錄并通過PCR擴(kuò)增、亞克隆并測序。miRNA前體在基因組上的定位和聚類是通過向基因組數(shù)據(jù)庫查詢進(jìn)行。這個方法有助于判斷miRNAs是否是mRNAs、tRNAs、rRNAs等分子的降解產(chǎn)物。

有的實(shí)驗(yàn)室通過一種RNA folding program ’mfold’ 來判斷C. elegans 和C. briggsae 之間的高度保守區(qū)域是否含有潛在的miRNA前體，然后用Northern Blots的方法來確定這些miRNAs是否真的表達(dá)了。

盡管有數(shù)百個miRNAs通過生化或者是生物信息學(xué)的方法被鑒別出來，已經(jīng)鑒別出來的miRNAs只不過是滄海一粟，由于很多已經(jīng)鑒別出來的miRNAs是從單個克隆中鑒別出來的，所以可以假設(shè)還有很多miRNAs在分離和鑒定過程中被“漏掉”了，測序工作還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。

miRNA和siRNA的關(guān)系

miRNA和siRNA之間的關(guān)系令人迷惑。從表面上說，一個是非編碼的單鏈小分子RNA，在進(jìn)化上高度保守，通過翻譯抑制調(diào)控基因表達(dá)而不影響轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性;另一個是針對編碼區(qū)的雙鏈小分子RNA，每個轉(zhuǎn)錄本都可能有很多個siRNAs，是通過降解目標(biāo)靶，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)。由于每個mRNA模版可能產(chǎn)生很多個siRNAs，要給每個siRNA定一個基因的名字就很困難。miRNA是進(jìn)化進(jìn)程中高度保守的，因此給直向同源物一個同樣的名字可能有助于了解他們的功能，而給另一個物種中一段無關(guān)的序列一個同樣的名字就容易造成混亂。

然而，據(jù)推測miRNAs通常是由較大的(70­90 nt)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)(發(fā)夾結(jié)構(gòu))前體經(jīng)Dicer酶切割得到的，而Dicer同樣負(fù)責(zé)將長雙鏈RNA切割為siRNA，而且二者的長度也差不多，同樣有調(diào)控基因表達(dá)功能。因而這兩類小分子RNA之間的關(guān)系格外令人關(guān)注。

兩個廣為人知的miRNA——在線蟲中發(fā)現(xiàn)的lin-4 和let-7，可以通過部分互補(bǔ)結(jié)合到目的mRNA靶的3’非編碼區(qū)(3’UTRs)，通過一種未知方式誘發(fā)蛋白質(zhì)翻譯抑制從而抑制蛋白質(zhì)合成。這種結(jié)合并不誘導(dǎo)mRNA靶的降解，就是說作為翻譯抑制子本身不影響對應(yīng)mRNA的豐度，其原因據(jù)推測是由于miRNA和結(jié)合位點(diǎn)之間不*互補(bǔ)。這就區(qū)別于 siRNA的介導(dǎo)的mRNA的降解。但是其他一些miRNAs可能以類似siRNA的方式介導(dǎo)目的RNA的降解。實(shí)驗(yàn)表明引入和let-7目的mRNA靶*互補(bǔ)的miRNA會誘導(dǎo)mRNA靶的降解。還有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明一些miRNA，包括在植物中發(fā)現(xiàn)的Scarecrow miRNA，能結(jié)合*互補(bǔ)的mRNA鏈從而降解mRNA序列，抑制蛋白合成。這提示miRNAs可以和siRNAs一樣作用，這兩種小分子RNA作用通路可能有重疊的部分。這種重疊同樣提示siRNAs可能也有和miRNAs同樣的功能。

一個很有趣的實(shí)驗(yàn)證實(shí)這個觀點(diǎn)：Doench和同事挑選一個已知在體內(nèi)可以有效使CXCR4基因沉默的siRNA，然后在熒光素酶報告基因的3’端插入對應(yīng)的CXCR4結(jié)合位點(diǎn)——其中一個拷貝是插入一個*匹配的CXCR4結(jié)合位點(diǎn)，另一個拷貝插入4個只有3’和5’端匹配，而中間不同的CXCR4結(jié)合位點(diǎn)，這樣選定的siRNA就不能*結(jié)合到這個結(jié)合位點(diǎn)——中間形成一個突起的不匹配的環(huán)。將這兩個拷貝轉(zhuǎn)入Hela細(xì)胞并用siRNA誘導(dǎo)基因沉默。結(jié)果很有趣——兩個實(shí)驗(yàn)都錄得熒光素酶活性下降了超過10倍，RT-PCR和Northern分析證實(shí)，*個實(shí)驗(yàn)的熒光素酶轉(zhuǎn)錄本下降了超過10倍，這正是正常的siRNA介導(dǎo)的RNAi反應(yīng)，目標(biāo)靶mRNA降解導(dǎo)致表達(dá)水平的下降，而第二個實(shí)驗(yàn)中熒光素酶轉(zhuǎn)錄本僅僅下降1.2倍，這種目的基因表達(dá)水平下看起來象源于miRNA介導(dǎo)的翻譯抑制降，而不是siRNA介導(dǎo)的影響mRNA的穩(wěn)定性導(dǎo)致。實(shí)驗(yàn)表明：siRNA可能以miRNA的方式作用于 mRNA。實(shí)驗(yàn)人員還進(jìn)行了另一個實(shí)驗(yàn)：改變第二個實(shí)驗(yàn)中的不匹配環(huán)的堿基序列看起來不影響抑制效果，但是siRNA和報告基因上的結(jié)合位點(diǎn)的匹配程度越高抑制效果越好，增加siRNA的量，抑制效果越好——這一點(diǎn)和siRNA抑制的情況一樣——*不同的是：*匹配的結(jié)合位點(diǎn)(siRNA作用方式)可以單獨(dú)起作用而相互不影響，而增加不*配對的結(jié)合位點(diǎn)(注意在第二個實(shí)驗(yàn)中用了4個CXCR4結(jié)合位點(diǎn))的個數(shù)對翻譯抑制有顯著的加乘作用。

在哺乳動物細(xì)胞中還沒有找到內(nèi)源的siRNA，外源的siRNA介導(dǎo)的RNAi作用正是一種抵御機(jī)制。而miRNAs則廣泛存在于哺乳動物細(xì)胞中，從理論上推測可能參與多種調(diào)控作用。這兩種小東西的作用機(jī)制和相互關(guān)系的本質(zhì)就顯得更加撲朔迷離。如何在實(shí)驗(yàn)中正確鑒定siRNA和miRNA，甚至是其他的小分子RNA都成為一個值得關(guān)注的問題。

未來要解決的問題

miRNAs在多個物種中廣泛被發(fā)現(xiàn)，而且在進(jìn)化上高度保守。這些“小玩意兒”留給我們一大堆謎團(tuán)：miRNA的確切功能是什么?它的目標(biāo)靶是什么?作用機(jī)制是什么?也許需要對植物或者線蟲的基因組進(jìn)行miRNAs突變株的篩選，在果蠅中可以用targeted-disruption缺失miRNA序列。對miRNA突變株伴隨的表型缺失進(jìn)行研究，有助于解釋miRNAs的功能。

正如Phillip Zamore說的：“如果miRNAs在進(jìn)化的進(jìn)程中如此高度保守而沒有任何實(shí)際功能，那真是大自然拿科研人員開涮——而且是一個殘酷的玩笑”。

研究miRNA的新工具

隨著小分子RNA日益收受到研究人員的重視，很多研究小分子RNA的新方法不斷推出。

小分子RNA的分離

由于小分子RNA可能參與分化、發(fā)育、組織生長、脂肪代謝等生理過程，在不同的組織和發(fā)育階段的表達(dá)水平有所不同，進(jìn)一步了解小分子RNA的生物功能需要確定其在各種生物樣品中的表達(dá)水平，因而需要一種的定量純化方法，從而得到可信的數(shù)據(jù)。

現(xiàn)行的RNA純化方法包括有機(jī)溶劑抽提+乙醇沉淀，或者是采用更加方便快捷的硅膠膜離心柱的方法來純化RNA。由于硅膠膜離心柱通常只富集較大分子的 RNA(200nt以上)，小分子RNA往往被淘汰掉，因而不適用于小分子RNA的分離純化。有機(jī)溶劑抽提能夠較好的保留小分子RNA，但是后繼的沉淀步驟比較費(fèi)時費(fèi)力。mirVana miRNA Isolation Kit是采用玻璃纖維濾膜離心柱(glass fiber filter，GFF)，既能夠有效富集10mer以上的RNA分子，又能夠兼?zhèn)潆x心柱快速離心純化的優(yōu)點(diǎn)，是一個不錯的選擇。對于特別稀有的分子，由于需要分離大量RNA而導(dǎo)致高背景而降低靈敏度，還可以進(jìn)一步富集10mer到200bp的小分子RNA來提高靈敏度。

小分子RNA探針的制備

方法其實(shí)很簡單：只需要準(zhǔn)備目的基因的一小段寡核苷酸序列，3’端另外增加8個和T7啟動子互補(bǔ)的堿基，將這段寡核苷酸和T7啟動子引物退火，用 Klenow大片斷補(bǔ)齊得到雙鏈的轉(zhuǎn)錄模版，然后用T7 RNA聚合酶、rNTP和標(biāo)記物混合，體外轉(zhuǎn)錄得到標(biāo)記的小分子RNA探針。這種方法可以快速制備各種標(biāo)記(同位素、非放射性標(biāo)記均可)的小于100nt 的小分子RNA探針，適用于包括RPAs，Northerns 和原位雜交等各種方法檢測小分子核仁RNA( small nuclear RNA,snRNA)，small interfering RNA (siRNA),，micro RNA (miRNA)和 mRNA。非放射性標(biāo)記的探針還可以用于原位雜交研究miRNA或者mRNA在組織中的分布。

小分子RNA的檢測

由于小分子RNA是一類很小的分子，部分小分子RNA表達(dá)水平可能很低，因而需要極為靈敏而定量的分析工具。由于其分子很小，用RT-PCR的方法來定量研究非常困難，目前多數(shù)研究人員采用Northern Blots——一種技術(shù)復(fù)雜而費(fèi)力的方法來檢測小分子RNA的存在。傳統(tǒng)的Northern Blot的方法是是用探針檢測固相支持物(膜)上的目標(biāo)分子，由于用探針檢測液相中的目標(biāo)分子遠(yuǎn)比檢測固相中的目標(biāo)更為靈敏，生物通在這里為大家推薦一種基于核酶保護(hù)分析方法改進(jìn)的新方法——將同位素標(biāo)記好的小分子RNA探針和待檢測樣品混合雜交，未雜交的RNA和多余的探針用單鏈核酸酶消化，然后使核酸酶失活，并純化雜交的RNA分子，zui后通過變性膠電泳放射自顯影檢測結(jié)果。這個基于液相雜交的新方法不但操作簡單而快速，而且靈敏度*——可以半定量檢測少至10ng總RNA模版中的小分子RNA，或者說，可以檢測attomole (10-18 mol)級別的靶目標(biāo)!靈敏度是Northern Blot的100倍。除此之外，研究人員還可以在同一個樣品中同時檢測多個小分子RNA和長的RNA模版。應(yīng)該說，這個靈活巧妙的設(shè)計(jì)可以為從事小分子 RNA實(shí)驗(yàn)的研究人員帶來不少方便。

總而言之，無論是siRNA, miRNA, snRNA還是其他的小東西，小分子RNA研究的不斷深入將幫助我們揭示更多生命的奧秘。