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重組體DNA分子的選擇與鑒定
點(diǎn)擊次數(shù)：2509 發(fā)布時(shí)間：2016-7-18
“選擇”(selection)和“篩選”(screening)的基本含義。
選擇，是指通過某種外來(lái)附加壓力(或因素)的辨別作用，呈現(xiàn)具有重組DNA分子的特定克隆類型的一種方法。選擇所涉及的范圍較為廣泛，包括根據(jù)克隆載體提供的表型特征的簡(jiǎn)單選擇(simple selection)，和根據(jù)突變的互補(bǔ)作用對(duì)克隆基因的直接選擇(direct selection)。
篩選則是指通過某種特定的方法，從被分析的細(xì)胞群體或基因文庫(kù)中，鑒定出真正具有所需要重組DNA分子的特定克隆的過程。
一.遺傳檢測(cè)法
(1)根據(jù)載體表型特征選擇重組體分子的直接選擇法
在基因工程中使用的所有的載體分子，都帶有一個(gè)可選擇遺傳標(biāo)記或表型特征。遺傳選擇法使我們能夠?qū)⒅亟M體的DNA分子同非重組體的親本載體分子區(qū)別開來(lái)。
(i)抗藥性記號(hào)插入失活選擇法
pBR322質(zhì)粒具有編碼有四環(huán)素抗性基因(tetr)和氨芐青霉素抗性基因(ampr)，只要將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培養(yǎng)在含有四環(huán)素或氨芐青霉素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，便可以容易地檢測(cè)出獲得此種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞(圖6-19)。
(ii)β-半乳糖苷酸顯色反應(yīng)選擇法
根據(jù)插入失活原理，將外源DNA插入到它的lacZ基因上所造成β-半乳糠苷酶失活效應(yīng)，可以通過大腸桿菌轉(zhuǎn)化子菌落在Xgal-IPTG培養(yǎng)基中的顏色變化直接觀察出來(lái)。β-半乳糖苷酶會(huì)把乳糖水解成半乳糖和葡萄糖(圖6-20)。
(2)根據(jù)插入序列的表型特征選擇重組體分子的直接選擇法
這種選擇法依據(jù)的基本原理是，轉(zhuǎn)化進(jìn)來(lái)的外源DNA編碼的基因，能夠?qū)Υ竽c桿菌寄主菌株所具有的突變發(fā)生體內(nèi)抑制或互補(bǔ)效應(yīng)，從而使被轉(zhuǎn)化的寄主細(xì)胞表現(xiàn)出外源基因編碼的表型特征。
二.物理檢測(cè)法
(1)凝膠電泳檢測(cè)法
質(zhì)粒DNA的電泳遷移率是與其分子量大小成比例的。因此，那些帶有外源DNA插入序列的分子量較大的重組體DNA，在凝膠中的遷移速度，就要比不具有外源DNA插入序列的分子量較小的質(zhì)粒DNA來(lái)得緩慢些根據(jù)這種差別，就可以容易地鑒定出哪些菌落是含有具外源NDA插入序列的分子量較大的重組質(zhì)粒。
(2)R-環(huán)檢測(cè)法
在臨近雙鏈DNA變性溫度下和高濃度(70%)的甲酰胺溶液中，即所謂的形成R-環(huán)的條件下，雙鏈的DNA-RNA分子要比雙鏈的DNA-DNA分子更為穩(wěn)定。因此，將RNA及DNA的混合物置于這種退火條件下，RNA便會(huì)同它的雙鏈DNA分子中的互補(bǔ)序列退火形成穩(wěn)定的DNA-RNA雜交分子，而使被取代的另一鏈處于單鏈狀態(tài)。這種由單鏈DNA分支和雙鏈DNA-RNA分支形成的“泡狀”體，叫做R-環(huán)結(jié)構(gòu)。R-環(huán)結(jié)構(gòu)一旦形成就十分穩(wěn)定，而且可以在電子顯微銳下觀察到(圖6-21)。所以，應(yīng)用R-環(huán)檢測(cè)法，可以鑒定出雙鏈DNA中存在的與特定RNA分子同源的區(qū)域。
三.菌落或噬菌斑雜交篩選法
將被篩選的大腸桿菌菌落，從其生長(zhǎng)的瓊脂平板中小心地轉(zhuǎn)移到鋪放在瓊脂平板表同的硝酸纖維素濾膜上，而后進(jìn)行適當(dāng)?shù)臏赜Ｈ〕鲆呀?jīng)長(zhǎng)有菌落的硝酸纖維素濾膜，使用堿液處理，使 DNA變性。然后再用適當(dāng)?shù)霓k法處理濾膜以除去蛋白質(zhì)，留下的便是同硝酸纖維素濾膜結(jié)合的變性DNA。變性DNA同硝酸纖維素濾膜有很強(qiáng)的親全力，這樣便形成了菌落的“DNA印跡”。在80℃下烘烤濾膜，以使DNA牢固地固定下來(lái)。將這些濾膜同放射性標(biāo)記的DNA或RNA探針雜交，并通過放射自顯影檢測(cè)雜交的結(jié)果。含有同探針互補(bǔ)的DNA的菌落，在X光底片上呈現(xiàn)黑色的斑點(diǎn)(圖6-22)，通過同原培養(yǎng)基平板上菌落位置的對(duì)照，挑選出陽(yáng)性菌落，便是我們所需要的含有目的基因插入片段的重組體克隆。
四.免疫化學(xué)檢測(cè)法
直接的免疫化學(xué)檢測(cè)技術(shù)，同菌落雜交技術(shù)在程度上是十分類似的。它是用抗體鑒定那引起產(chǎn)生外源DNA編碼的抗原的菌落或噬菌斑。只要當(dāng)一個(gè)克隆的目的基因，能夠在大腸桿菌寄生細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)表達(dá)，合成出外源的蛋白質(zhì)，就可以采用免疫化學(xué)法檢測(cè)重組體克隆。
免疫化學(xué)檢測(cè)法可分為放射性抗體測(cè)定法(radioactive antibody test)，和免疫沉淀測(cè)定法(immunoprecipitation test)。這些方法zui突出的優(yōu)點(diǎn)是，它們能夠檢測(cè)不為寄主提供任何可選擇的表型特征的克隆基因。