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重組體DNA分子的選擇與鑒定
點擊次數:2482 發布時間:2016-7-18
“選擇”(selection)和“篩選”(screening)的基本含義。
選擇,是指通過某種外來附加壓力(或因素)的辨別作用,呈現具有重組DNA分子的特定克隆類型的一種方法。選擇所涉及的范圍較為廣泛,包括根據克隆載體提供的表型特征的簡單選擇(simple selection),和根據突變的互補作用對克隆基因的直接選擇(direct selection)。
篩選則是指通過某種特定的方法,從被分析的細胞群體或基因文庫中,鑒定出真正具有所需要重組DNA分子的特定克隆的過程。
一.遺傳檢測法
(1)根據載體表型特征選擇重組體分子的直接選擇法
在基因工程中使用的所有的載體分子,都帶有一個可選擇遺傳標記或表型特征。遺傳選擇法使我們能夠將重組體的DNA分子同非重組體的親本載體分子區別開來。
(i)抗藥性記號插入失活選擇法
pBR322質粒具有編碼有四環素抗性基因(tetr)和氨芐青霉素抗性基因(ampr),只要將轉化的細胞培養在含有四環素或氨芐青霉素的生長培養基中,便可以容易地檢測出獲得此種質粒的轉化子細胞(圖6-19)。
(ii)β-半乳糖苷酸顯色反應選擇法
根據插入失活原理,將外源DNA插入到它的lacZ基因上所造成β-半乳糠苷酶失活效應,可以通過大腸桿菌轉化子菌落在Xgal-IPTG培養基中的顏色變化直接觀察出來。β-半乳糖苷酶會把乳糖水解成半乳糖和葡萄糖(圖6-20)。
(2)根據插入序列的表型特征選擇重組體分子的直接選擇法
這種選擇法依據的基本原理是,轉化進來的外源DNA編碼的基因,能夠對大腸桿菌寄主菌株所具有的突變發生體內抑制或互補效應,從而使被轉化的寄主細胞表現出外源基因編碼的表型特征。
二.物理檢測法
(1)凝膠電泳檢測法
質粒DNA的電泳遷移率是與其分子量大小成比例的。因此,那些帶有外源DNA插入序列的分子量較大的重組體DNA,在凝膠中的遷移速度,就要比不具有外源DNA插入序列的分子量較小的質粒DNA來得緩慢些根據這種差別,就可以容易地鑒定出哪些菌落是含有具外源NDA插入序列的分子量較大的重組質粒。
(2)R-環檢測法
在臨近雙鏈DNA變性溫度下和高濃度(70%)的甲酰胺溶液中,即所謂的形成R-環的條件下,雙鏈的DNA-RNA分子要比雙鏈的DNA-DNA分子更為穩定。因此,將RNA及DNA的混合物置于這種退火條件下,RNA便會同它的雙鏈DNA分子中的互補序列退火形成穩定的DNA-RNA雜交分子,而使被取代的另一鏈處于單鏈狀態。這種由單鏈DNA分支和雙鏈DNA-RNA分支形成的“泡狀”體,叫做R-環結構。R-環結構一旦形成就十分穩定,而且可以在電子顯微銳下觀察到(圖6-21)。所以,應用R-環檢測法,可以鑒定出雙鏈DNA中存在的與特定RNA分子同源的區域。
三.菌落或噬菌斑雜交篩選法
將被篩選的大腸桿菌菌落,從其生長的瓊脂平板中小心地轉移到鋪放在瓊脂平板表同的硝酸纖維素濾膜上,而后進行適當的溫育。取出已經長有菌落的硝酸纖維素濾膜,使用堿液處理,使 DNA變性。然后再用適當的辦法處理濾膜以除去蛋白質,留下的便是同硝酸纖維素濾膜結合的變性DNA。變性DNA同硝酸纖維素濾膜有很強的親全力,這樣便形成了菌落的“DNA印跡”。在80℃下烘烤濾膜,以使DNA牢固地固定下來。將這些濾膜同放射性標記的DNA或RNA探針雜交,并通過放射自顯影檢測雜交的結果。含有同探針互補的DNA的菌落,在X光底片上呈現黑色的斑點(圖6-22),通過同原培養基平板上菌落位置的對照,挑選出陽性菌落,便是我們所需要的含有目的基因插入片段的重組體克隆。
四.免疫化學檢測法
直接的免疫化學檢測技術,同菌落雜交技術在程度上是十分類似的。它是用抗體鑒定那引起產生外源DNA編碼的抗原的菌落或噬菌斑。只要當一個克隆的目的基因,能夠在大腸桿菌寄生細胞中實現表達,合成出外源的蛋白質,就可以采用免疫化學法檢測重組體克隆。
免疫化學檢測法可分為放射性抗體測定法(radioactive antibody test),和免疫沉淀測定法(immunoprecipitation test)。這些方法zui突出的優點是,它們能夠檢測不為寄主提供任何可選擇的表型特征的克隆基因。