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重組DNA的轉(zhuǎn)化和藍白篩選
點擊次數(shù):1824 發(fā)布時間:2016-7-15
體外連接的重組DNA分子導(dǎo)入合適的受體細胞才能進行大量復(fù)制,增殖和表達,其首要目的是獲得大量的克隆基因。雖然PCR技術(shù),體外轉(zhuǎn)錄及翻譯系統(tǒng)能部分達到大量擴增的目的,但畢竟受到體外操作的許多限制。重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細胞zui常用的方法之一就是轉(zhuǎn)化(transformation)。轉(zhuǎn)化這一概念來源于遺傳學(xué):細菌細胞的生物學(xué)由于吸收外源DNA發(fā)生可遺傳的改變叫轉(zhuǎn)化。很多細菌如桿菌,鏈霉菌屬能自然發(fā)生轉(zhuǎn)化,其它菌屬包括大腸桿菌自然狀態(tài)下無法發(fā)生轉(zhuǎn)化,但可以通過人工誘導(dǎo)使其處在易于接受外源DNA分子的狀態(tài)即感受態(tài)(competence),從而使轉(zhuǎn)化得以率地進行。大腸桿菌的轉(zhuǎn)化簡便易行,它在分子克隆中占據(jù)極為重要的地位。重組DNA轉(zhuǎn)化細菌的技術(shù)操作關(guān)鍵就是通過化學(xué)方法,人工誘導(dǎo)細菌細胞進入一個敏感的感受態(tài),以便外源DNA進入細菌內(nèi),這項技術(shù)始于Mandel 和Higa 1970年的觀察,他們發(fā)現(xiàn)細菌經(jīng)過冰冷的CaCl2 溶液處理短暫熱休克后,容易被噬菌體感染,隨后Cohn 于1972年進一步證明質(zhì)粒DNA用同樣的方法也能進入細菌。其原理是細菌處于0℃,CaCl2低滲溶液中,細菌細胞膨脹成球形,轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase 的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘付于細胞表面,經(jīng)42℃短時間的熱激處理,促進細胞吸收復(fù)合物。在富裕培養(yǎng)基中生長一小時后,質(zhì)粒拷貝數(shù)增加,抗性基因得以表達,球形的感受態(tài)細胞得以復(fù)原。zui后通過含抗生素的抗性平板篩選轉(zhuǎn)化菌落。
Ca 2 處理的感受態(tài)細胞,一般轉(zhuǎn)化率為105-106/ug DNA。環(huán)化重組質(zhì)粒愈小,轉(zhuǎn)化率愈高,環(huán)狀DNA分子比線狀DNA分子的轉(zhuǎn)化率高。在Ca2 的基礎(chǔ)上,聯(lián)合其他金屬離子( 如 Mn2 、Co2 ),DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細菌,使轉(zhuǎn)化率提高數(shù)百倍。
除化學(xué)法轉(zhuǎn)化細菌外,還有電擊轉(zhuǎn)化法,電擊法不需要預(yù)先誘導(dǎo)細菌的感受態(tài),依靠短暫的電擊,促使DNA進入細菌,轉(zhuǎn)化率zui高達到109-10/ug DNA,因操作簡便愈來愈為人們所接受。
基因克隆的zui后一道工序就是從眾多的轉(zhuǎn)化菌中篩選出目的陽性克隆并鑒定重組子的正確性。通過細菌培養(yǎng)以及重組子的擴增,從而獲得目的基因的大量拷貝,進一步研究該基因的結(jié)構(gòu)、功能或表達產(chǎn)物。從大量的菌落或噬菌斑中鑒定出重組子有許多方法,如插入失活法、抗性篩選、藍白篩選、雜交篩選、免疫學(xué)篩選、酶切圖譜鑒定、PCR鑒定等。而藍白篩選常用在重組子和非重組子的初步篩選中,它是通過載體和宿主菌之間基因內(nèi)互補來實現(xiàn)。許多載體(如pUC,pBS等)都是帶有包括乳糖操縱子的調(diào)控序列和編碼β-半乳糖苷酶前146個氨基酸的基因序列。并在編碼區(qū)中構(gòu)建了多克隆位點,它不破壞讀框,可使幾個氨基酸插入到β-半乳糖苷酶基因的氨基端,而不影響功能。若有外源基因插入多克隆位點則破壞編碼讀框產(chǎn)生沒活性的α肽段。宿主菌為缺失產(chǎn)生α肽段的突變體,但能產(chǎn)生其余肽段。兩者之間進行基因內(nèi)互補就產(chǎn)生有活性的β-半乳糖苷酶基因。β-半乳糖苷酶基因在IPTG的誘導(dǎo)下產(chǎn)生肽段與宿主菌其余肽段結(jié)合成有活性的β-半乳糖苷酶 。此酶能使顯色底物X-gal分解成藍色化合物,從而使菌落發(fā)藍。若有外源片段插入載體的多克隆位點,則使β-半乳糖苷酶基因失活,不能產(chǎn)生α肽,形成白色菌落。利用此方法僅通過目測就輕而一舉地篩選出重組菌落。
一、材料,試劑和儀器
1 材料: 受體菌DH5α ,含lacZ`的重組質(zhì)粒。
2 試劑:
1)LB固體培養(yǎng)基
2)LB液體培養(yǎng)基
4)0.1mol/L CaCl2
5)抗生素母液
6) 0.5mol/L IPTG
7) 100mg/mL X-gal
表2 常用抗菌素的作用方式及其抗性機理
3儀器: 恒溫搖床, 冰凍離心機,恒溫培養(yǎng)箱,
CaCl2轉(zhuǎn)化法
(1) 劃線復(fù)壯宿主菌37℃。挑一單菌落于30mL LB液體培養(yǎng)基中,37℃,200rpm搖至OD600=0.2-0.4,取出置于冰上10-15min。
(2) 取1mL菌液于滅菌的1.5mL離心管中。4℃,5000rpm離心5min回收細胞。棄上清,吸干殘存培養(yǎng)基,加500μl冰預(yù)冷的0.1M CaCl2,重懸菌體,置冰浴15-30min。
4℃,5000rpm離心5min回收細胞。棄上清,吸干水,加100μl冰預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸菌體。放置于4℃用于轉(zhuǎn)化,若不用則加30%甘油置-70℃?zhèn)浯妗?/p>
(3) 加入10μl連接產(chǎn)物到100ul感受態(tài)細胞中,輕旋以混和內(nèi)含物,置于冰上30min。
(4) 42℃熱休克90sec,不要搖動試管。置冰上1-2min。
(5) 加400ul 液體培養(yǎng)基,37℃150rpm搖培45-60min。
(6) 微波爐融化LB固體培養(yǎng)基,待冷卻至50℃左右時,根據(jù)載體的抗性加入相應(yīng)的抗生素,如Km 母液至終濃度50ug/mL或Amp母液至終濃度60ug/mL ,搖勻。趁熱倒平板,每板20mL左右,室溫下凝固10-15min。
(7) 取適量菌液(體積別超過200 ul,如果想多涂菌可以先室溫下5000rpm離心5min回收細胞,棄去一部分培養(yǎng)基后,重懸細菌后再涂),加入5ul IPTG(0.5M) 和30ul X-gal (100mg/mL) ,混勻,加到抗性平板上,用燒過滅菌的涂布器涂布器涂勻,涂布器應(yīng)涼下來用,否則容易燙死細菌。
(8) 培養(yǎng)皿用石蠟?zāi)し夂煤螅?7℃倒置培養(yǎng)。待出現(xiàn)藍色時取出放在4℃冰箱中,使其顏色更加明顯。
注意: 1 )質(zhì)粒DNA要純 2 )受體細菌的OD600nm=0.3-0.4 3) 重組質(zhì)粒的體積小于轉(zhuǎn)化菌液體積的1/10。
三、結(jié)果與分析
若抗性平板上出現(xiàn)白色菌落,說明連接的重組質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化。根據(jù)藍白的比例可以判斷重組率,根據(jù)菌落數(shù)目可以計算出轉(zhuǎn)化率。一般來說采用定向連接的重組質(zhì)粒的重組率較高,而平末端或單一酶切位點連接的重組率較低。
轉(zhuǎn)化是一定設(shè)不加質(zhì)粒只含感受態(tài)宿主菌的負對照和加入已知抗性的質(zhì)粒的正對照,以便分析結(jié)果。如果負對照長出菌落說明感受態(tài)宿主菌具有抗性或抗生素失活,而正對照沒出來,說明感受態(tài)細胞有問題或加錯抗生素或操作過程中造成細菌死亡(如涂布時燙死)。