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重組DNA的轉化和藍白篩選
點擊次數：1931 發布時間：2016-7-15
體外連接的重組DNA分子導入合適的受體細胞才能進行大量復制，增殖和表達，其首要目的是獲得大量的克隆基因。雖然PCR技術，體外轉錄及翻譯系統能部分達到大量擴增的目的，但畢竟受到體外操作的許多限制。重組質粒導入宿主細胞zui常用的方法之一就是轉化(transformation)。轉化這一概念來源于遺傳學：細菌細胞的生物學由于吸收外源DNA發生可遺傳的改變叫轉化。很多細菌如桿菌，鏈霉菌屬能自然發生轉化，其它菌屬包括大腸桿菌自然狀態下無法發生轉化，但可以通過人工誘導使其處在易于接受外源DNA分子的狀態即感受態(competence)，從而使轉化得以率地進行。大腸桿菌的轉化簡便易行，它在分子克隆中占據極為重要的地位。重組DNA轉化細菌的技術操作關鍵就是通過化學方法，人工誘導細菌細胞進入一個敏感的感受態，以便外源DNA進入細菌內，這項技術始于Mandel 和Higa 1970年的觀察，他們發現細菌經過冰冷的CaCl2 溶液處理短暫熱休克后，容易被噬菌體感染，隨后Cohn 于1972年進一步證明質粒DNA用同樣的方法也能進入細菌。其原理是細菌處于0℃，CaCl2低滲溶液中，細菌細胞膨脹成球形，轉化混合物中的DNA形成抗DNase 的羥基-鈣磷酸復合物粘付于細胞表面，經42℃短時間的熱激處理，促進細胞吸收復合物。在富裕培養基中生長一小時后，質粒拷貝數增加，抗性基因得以表達，球形的感受態細胞得以復原。zui后通過含抗生素的抗性平板篩選轉化菌落。
Ca 2 處理的感受態細胞，一般轉化率為105-106/ug DNA。環化重組質粒愈小，轉化率愈高，環狀DNA分子比線狀DNA分子的轉化率高。在Ca2 的基礎上，聯合其他金屬離子( 如 Mn2 、Co2 )，DMSO或還原劑等物質處理細菌，使轉化率提高數百倍。
除化學法轉化細菌外，還有電擊轉化法，電擊法不需要預先誘導細菌的感受態，依靠短暫的電擊，促使DNA進入細菌，轉化率zui高達到109-10/ug DNA，因操作簡便愈來愈為人們所接受。
基因克隆的zui后一道工序就是從眾多的轉化菌中篩選出目的陽性克隆并鑒定重組子的正確性。通過細菌培養以及重組子的擴增，從而獲得目的基因的大量拷貝，進一步研究該基因的結構、功能或表達產物。從大量的菌落或噬菌斑中鑒定出重組子有許多方法，如插入失活法、抗性篩選、藍白篩選、雜交篩選、免疫學篩選、酶切圖譜鑒定、PCR鑒定等。而藍白篩選常用在重組子和非重組子的初步篩選中，它是通過載體和宿主菌之間基因內互補來實現。許多載體(如pUC,pBS等)都是帶有包括乳糖操縱子的調控序列和編碼β-半乳糖苷酶前146個氨基酸的基因序列。并在編碼區中構建了多克隆位點，它不破壞讀框，可使幾個氨基酸插入到β-半乳糖苷酶基因的氨基端，而不影響功能。若有外源基因插入多克隆位點則破壞編碼讀框產生沒活性的α肽段。宿主菌為缺失產生α肽段的突變體，但能產生其余肽段。兩者之間進行基因內互補就產生有活性的β-半乳糖苷酶基因。β-半乳糖苷酶基因在IPTG的誘導下產生肽段與宿主菌其余肽段結合成有活性的β-半乳糖苷酶 。此酶能使顯色底物X-gal分解成藍色化合物，從而使菌落發藍。若有外源片段插入載體的多克隆位點，則使β-半乳糖苷酶基因失活，不能產生α肽，形成白色菌落。利用此方法僅通過目測就輕而一舉地篩選出重組菌落。
一、材料，試劑和儀器
1 材料: 受體菌DH5α ，含lacZ`的重組質粒。
2 試劑:
1)LB固體培養基
2)LB液體培養基
4)0.1mol/L CaCl2
5)抗生素母液
6) 0.5mol/L IPTG
7) 100mg/mL X-gal
表2 常用抗菌素的作用方式及其抗性機理
3儀器: 恒溫搖床， 冰凍離心機，恒溫培養箱，
CaCl2轉化法
(1) 劃線復壯宿主菌37℃。挑一單菌落于30mL LB液體培養基中，37℃，200rpm搖至OD600=0.2-0.4，取出置于冰上10-15min。
(2) 取1mL菌液于滅菌的1.5mL離心管中。4℃,5000rpm離心5min回收細胞。棄上清，吸干殘存培養基，加500μl冰預冷的0.1M CaCl2,重懸菌體，置冰浴15-30min。
4℃,5000rpm離心5min回收細胞。棄上清，吸干水，加100μl冰預冷的0.1M CaCl2重懸菌體。放置于4℃用于轉化，若不用則加30%甘油置-70℃備存。
(3) 加入10μl連接產物到100ul感受態細胞中，輕旋以混和內含物，置于冰上30min。
(4) 42℃熱休克90sec，不要搖動試管。置冰上1-2min。
(5) 加400ul 液體培養基，37℃150rpm搖培45-60min。
(6) 微波爐融化LB固體培養基，待冷卻至50℃左右時，根據載體的抗性加入相應的抗生素，如Km 母液至終濃度50ug/mL或Amp母液至終濃度60ug/mL ，搖勻。趁熱倒平板，每板20mL左右，室溫下凝固10-15min。
(7) 取適量菌液(體積別超過200 ul，如果想多涂菌可以先室溫下5000rpm離心5min回收細胞，棄去一部分培養基后，重懸細菌后再涂)，加入5ul IPTG(0.5M) 和30ul X-gal (100mg/mL) ，混勻，加到抗性平板上，用燒過滅菌的涂布器涂布器涂勻，涂布器應涼下來用，否則容易燙死細菌。
(8) 培養皿用石蠟膜封好后，37℃倒置培養。待出現藍色時取出放在4℃冰箱中，使其顏色更加明顯。
注意: 1 )質粒DNA要純 2 )受體細菌的OD600nm=0.3-0.4 3) 重組質粒的體積小于轉化菌液體積的1/10。
三、結果與分析
若抗性平板上出現白色菌落，說明連接的重組質粒被轉化。根據藍白的比例可以判斷重組率，根據菌落數目可以計算出轉化率。一般來說采用定向連接的重組質粒的重組率較高，而平末端或單一酶切位點連接的重組率較低。
轉化是一定設不加質粒只含感受態宿主菌的負對照和加入已知抗性的質粒的正對照，以便分析結果。如果負對照長出菌落說明感受態宿主菌具有抗性或抗生素失活，而正對照沒出來，說明感受態細胞有問題或加錯抗生素或操作過程中造成細菌死亡(如涂布時燙死)。