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技術(shù)文章

重組質(zhì)粒的連接、轉(zhuǎn)化及篩選

點(diǎn)擊次數(shù):1577 發(fā)布時(shí)間:2016-7-12

質(zhì)粒具有穩(wěn)定可靠和操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。如果要克隆較小的dna片段(<10kb)且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,質(zhì)粒要比其它任何載體都要好。在質(zhì)粒載體上進(jìn)行克隆,從原理上說是很簡(jiǎn)單的,先用限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒DNA和目的DNA片段, 然后體外使兩者相連接, 再用所得到重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌,即可完成。但在實(shí)際工作中, 如何區(qū)分插入有外源DNA的重組質(zhì)粒和無插入而自身環(huán)化的載體分子是較為困難的。通過調(diào)整連接反應(yīng)中外源DNA片段和載體DNA的濃度比例,可以將載體的自身環(huán)化限制在一定程度之下,也可以進(jìn)一步采取一些特殊的克隆策略,如載體去磷酸化等來zui大限度的降低載體的自身環(huán)化,還可以利用遺傳學(xué)手段如α互補(bǔ)現(xiàn)象等來鑒別重組子和非重組子。

外源DNA片段和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)策略有以下幾種:

1、帶有非互補(bǔ)突出端的片段 用兩種不同的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化可以產(chǎn)生帶有非互補(bǔ)的粘性末端,這也是zui容易克隆的DNA片段,一般情況下,常用質(zhì)粒載體均帶有多個(gè)不同限制酶的識(shí)別序列組成的多克隆位點(diǎn),因而幾乎總能找到與外源DNA片段末端匹配的限制酶切位點(diǎn)的載體,從而將外源片段定向地克隆到載體上。也可在PCR擴(kuò)增時(shí),在DNA片段兩端人為加上不同酶切位點(diǎn)以便與載體相連。

2、帶有相同的粘性末端 用相同的酶或同尾酶處理可得到這樣的末端。 由于質(zhì)粒載體也必須用同一種酶消化,亦得到同樣的兩個(gè)相同粘性末端,因此在連接反應(yīng)中外源片段和質(zhì)粒載體DNA均可能發(fā)生自身環(huán)化或幾個(gè)分子串連形成寡聚物, 而且正反兩種連接方向都可能有。所以,必須仔細(xì)調(diào)整連接反應(yīng)中兩種DNA的濃度, 以便使正確的連接產(chǎn)物的數(shù)量達(dá)到zui高水平。還可將載體DNA的5'磷酸基團(tuán)用堿性磷酸酯酶去掉, zui大限度地抑制質(zhì)粒dna的自身環(huán)化。帶5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地與去磷酸化的載體相連, 產(chǎn)生一個(gè)帶有兩個(gè)缺口的開環(huán)分子,在轉(zhuǎn)入E. coli受體菌后的擴(kuò)增過程中缺口可自動(dòng)修復(fù)。

3、帶有平末端 是由產(chǎn)生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產(chǎn)生,或由DNA聚合酶補(bǔ)平所致。由于平端的連接效率比粘性末端要低得多,故在其連接反應(yīng)中,T4 dna連接酶的濃度和外源DNA及載體DNA濃度均要高得多。通常還需加入低濃度的聚乙二醇(PEG 8000)以促進(jìn)DNA分子凝聚成聚集體的物質(zhì)以提高轉(zhuǎn)化效率。

特殊情況下,外源DNA分子的末端與所用的載體末端無法相互匹配,則可以在線狀質(zhì)粒載體末端或外源DNA片段末端接上合適的接頭(linker)或銜接頭(adapter)使其匹配, 也可以有控制的使用E. coli dna聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3'凹端,使不相匹配的末端轉(zhuǎn)變?yōu)榛パa(bǔ)末端或轉(zhuǎn)為平末端后再進(jìn)行連接。

本實(shí)驗(yàn)所使用的載體質(zhì)粒DNA為PBS,轉(zhuǎn)化受體菌為E. coli DH5α菌株。由于pBS上帶有Ampr 和lacZ基因,故重組子的篩選采用Amp抗性篩選與α-互補(bǔ)現(xiàn)象篩選相結(jié)合的方法。

因pBS帶有Ampr 基因而外源片段上不帶該基因,故轉(zhuǎn)化受體菌后只有帶有pBS DNA的轉(zhuǎn)化子才能在含有Amp的LB平板上存活下來;而只帶有自身環(huán)化的外源片段的轉(zhuǎn)化子則不能存活。此為初步的抗性篩選。

pBS上帶有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調(diào)控序列和β-半乳糖苷酶N端146個(gè)氨基酸的編碼序列。這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn),但并沒有破壞lacZ的閱讀框架,不影響其正常功能。E. coli DH5α菌株帶有β-半乳糖苷酶C端部分序列的編碼信息。在各自獨(dú)立的情況下,pBS和DH5α編碼的β-半乳糖苷酶的片段都沒有酶活性。但在pBS和DH5α融為一體時(shí)可形成具有酶活性的蛋白質(zhì)。這種lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的β-半乳糖苷酸陰性突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)的現(xiàn)象叫α-互補(bǔ)。由α-互補(bǔ)產(chǎn)生的Lac+ 細(xì)菌較易識(shí)別,它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)誘導(dǎo)形成藍(lán)色菌落。當(dāng)外源片段插入到pBS質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)上后會(huì)導(dǎo)致讀碼框架改變, 表達(dá)蛋白失活, 產(chǎn)生的氨基酸片段失去α-互補(bǔ)能力, 因此在同樣條件下含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子在生色誘導(dǎo)培養(yǎng)基上只能形成白色菌落。在麥康凱培養(yǎng)基上,α-互補(bǔ)產(chǎn)生的Lac+細(xì)菌由于含β-半乳糖苷酶,能分解麥康凱培養(yǎng)基中的乳糖,產(chǎn)生乳酸,使pH下降,因而產(chǎn)生紅色菌落,而當(dāng)外源片段插入后,失去α-互補(bǔ)能力,因而不產(chǎn)生β-半乳糖苷酶,無法分解培養(yǎng)基中的乳糖,菌落呈白色。由此可將重組質(zhì)粒與自身環(huán)化的載體DNA分開。此為α-互補(bǔ)現(xiàn)象篩選。

材料、設(shè)備及試劑

一、 材料

外源DNA片段: 自行制備的帶限制性末端的DNA溶液,濃度已知; 載體DNA: pBS質(zhì)粒(Ampr ,lacZ),自行提取純化,濃度已知; 宿主菌: E. coli DH5α,或JM系列等具有α-互補(bǔ)能力的菌株。

二、 設(shè)備

恒溫?fù)u床,臺(tái)式高速離心機(jī),恒溫水浴鍋, 瓊脂糖凝膠電泳裝置, 電熱恒溫培養(yǎng)箱,電泳儀無菌,工作臺(tái), 微量移液槍,eppendorf管。

三、 試劑

1、連接反應(yīng)緩沖液(10×):0.5mol/L Tris·Cl (pH7.6),100mol/L MgCl2,100mol/L 二硫蘇糖醇(DTT)(過濾滅菌),500μg/ml 牛血清清蛋白(組分V.Sigma 產(chǎn)品)(可用可不用),10mol/L ATP(過濾滅菌)。

2、T4 DNA連接酶(T4 DNA ligase);購(gòu)買成品。

3、X-gal儲(chǔ)液(20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的儲(chǔ)液, 包以鋁箔或黑紙以防止受光照被破壞, 儲(chǔ)存于-20℃。

4、IPTG儲(chǔ)液(200mg/ml): 在800μl蒸餾水中溶解200mg IPTG后,用蒸餾水定容至1ml,用0.22μm濾膜過濾除菌,分裝于eppendorf管并儲(chǔ)于-20℃。

5、麥康凱選擇性培養(yǎng)基(Maconkey Agar):取52g麥康凱瓊脂加蒸餾水1000ml,微火煮沸至*浴解,高壓滅菌,待冷至60℃左右加入Amp儲(chǔ)存液使終濃度為50mg/ml,然后搖勻后涂板。

6、含X-gal和IPTG的篩選培養(yǎng)基:在事先制備好的含50μg/ml Amp的LB平板表面加40ml X-gal儲(chǔ)液和4μlIPTG儲(chǔ)液,用無菌玻棒將溶液涂勻,置于37℃下放置3-4小時(shí),使培養(yǎng)基表面的液體*被吸收。

7、感受態(tài)細(xì)胞制備試劑: 見第三章。

8、煮沸法快速分離質(zhì)粒試劑: 見*章。

9、質(zhì)粒酶及電泳試劑: 見第二章。

操作步驟

一、 連接反應(yīng)

1、取新的經(jīng)滅菌處理的0.5ml eppendorf管, 編號(hào)。

2、將0.1μg載體DNA轉(zhuǎn)移到無菌離心管中,加等摩爾量(可稍多)的外源DNA片段。

3、加蒸餾水至體積為8μl,于45℃保溫5分鐘,以使重新退火的粘端解鏈。將混和物冷卻至0℃。

4、加入10×T4 DNA ligase buffer 1μl, T4 DNA ligase 0.5μl, 混勻后用微量離心機(jī)將液體全部甩到管底,于16℃保溫8-24小時(shí)。

同時(shí)做二組對(duì)照反應(yīng),其中對(duì)照組一只有質(zhì)粒載體無外源DNA;對(duì)照組二只有外源DNA片段沒有質(zhì)粒載體。

二、 E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化

每組連接反應(yīng)混和物各取2μl轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞。具體方法見第三章。

三、 重組質(zhì)粒的篩選

1、每組連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化原液取100μl用無菌玻棒均勻涂布于篩選培養(yǎng)基上,37℃下培養(yǎng)半小時(shí)以上,直至液體被*吸收。

2、倒置平板于37℃繼續(xù)培養(yǎng)12-16小時(shí),待出現(xiàn)明顯而又未相互重疊的單菌落時(shí)拿出平板。

3、放于4℃數(shù)小時(shí),使顯色*(此步麥康凱培養(yǎng)基不做)。

不帶有pBS質(zhì)粒DNA的細(xì)胞,由于無Amp抗性,不能在含有Amp的篩選培養(yǎng)基上成活。帶有pBS載體的轉(zhuǎn)化子由于具有β-半乳糖苷酶活性,在麥康凱篩選培養(yǎng)基上呈現(xiàn)為紅色菌落。在X-gal和ITPG培養(yǎng)基上為藍(lán)色菌落。帶有重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子由于喪失了β-半乳糖苷酶活性,在麥康凱選擇性培養(yǎng)基和x-gal和ITPG培養(yǎng)基上均為白色菌落。

四、 酶切鑒定重組質(zhì)粒

用無菌牙簽挑取白色單菌落接種于含Amp 50μg/ml的 5ml LB液體培養(yǎng)基中,37℃下振蕩培養(yǎng)12小時(shí)。使用煮沸法快速分離質(zhì)粒DNA直接電泳,同時(shí)以煮沸法抽提的pBS質(zhì)粒做對(duì)照,有插入片段的重組質(zhì)粒電泳時(shí)遷移率較pBS慢。再用與連接未端相對(duì)應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)一步進(jìn)行酶切檢驗(yàn)。還可用雜交法篩選重組質(zhì)粒。

[注意] 1、DNA連接酶用量與DNA片段的性質(zhì)有關(guān),連接平齊末端,必須加大酶量,一般使用連接粘性末端酶量的10-100倍。

2、在連接帶有粘性末端的DNA片段時(shí),DNA濃度一般為2-10mg/ml,在連接平齊末端時(shí),需加入DNA濃度至100-200mg/ml。

3、連接反應(yīng)后,反應(yīng)液在0℃儲(chǔ)存數(shù)天,-80℃儲(chǔ)存2個(gè)月,但是在-20℃冰凍保存將會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

4、粘性末端形成的氫鍵在低溫下更加穩(wěn)定,所以盡管T4 DNA連接酶的zui適反應(yīng)溫度為37℃,在連接粘性末端時(shí),反應(yīng)溫度以10-16℃為好,平齊末端則以15-20℃為好。

5、在連接反應(yīng)中,如不對(duì)載體分子進(jìn)行去5'磷酸基處理,便用過量的外源DNA片段(2-5倍),這將有助于減少載體的自身環(huán)化,增加外源DNA和載體連接的機(jī)會(huì)。

6、麥康凱選擇性瓊脂組成的平板,在含有適當(dāng)抗生素時(shí),攜有載體DNA的轉(zhuǎn)化子為淡紅色菌落,而攜有帶插入片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子為白色菌落。該產(chǎn)品篩選效果同藍(lán)白斑篩選,且價(jià)格低廉。但需及時(shí)挑取白色菌落,當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),白色菌落會(huì)逐漸變成微紅色,影響挑選。

7、X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)以半乳糖苷酶(b-galactosidase)水解后生成的吲哚衍生物顯藍(lán)色。IPTG是異丙基硫代半乳糖苷(Isopropylthiogalactoside),為非生理性的誘導(dǎo)物,它可以誘導(dǎo)lacZ的表達(dá)。

8、在含有X-gal和IPTG的篩選培養(yǎng)基上,攜帶載體DNA的轉(zhuǎn)化子為藍(lán)色菌落,而攜帶插入片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子為白色菌落,平板如在37℃培養(yǎng)后放于冰箱3-4小時(shí)可使顯色反應(yīng)充分,藍(lán)色菌落明顯。

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