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受體菌感受態(tài)細(xì)胞的制備方法
點(diǎn)擊次數(shù):1372 發(fā)布時間:2016-7-4
目的與原理
當(dāng)細(xì)菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)時,即為感受態(tài),而用理化手段使細(xì)菌處于感受態(tài)的操作為致敏過程。感受態(tài)細(xì)胞制備是重組基因能否實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一個重要的技術(shù)環(huán)節(jié)。本試驗(yàn)是通過鈣離子來誘導(dǎo)使之成為感受態(tài)細(xì)胞。
二、材料和方法
1. 材料:大腸桿菌
2. 儀器:
離心機(jī),恒溫?fù)u床,恒溫水浴,超凈工作臺,冰柜
3. 試劑
lb培養(yǎng)基,0.1M MgCl2,3mM氯化六氮合高鈷
TFB:10Mm MES(pH6.3)
45Mm MnCl2
10Mm CaCl2
10Mm KCl
三、操作步驟
大腸桿菌在LB培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)12-16小時,挑取單菌落于LB培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)大腸桿菌到對數(shù)期。取1ml培養(yǎng)物7000rpm,離心3min,收集菌體。再重復(fù)一次。冰浴放置。用預(yù)冷的氯化鎂懸浮菌體7000rpm離心3min。收集菌體,冰浴放置。用預(yù)冷的氯化鈣懸浮菌體,冰浴15min, 7000rpm離心3min。收集菌體,冰浴放置。加入200μl預(yù)冷的氯化鈣(或TFB),放置于冰浴,即得感受態(tài)細(xì)胞,此細(xì)胞可現(xiàn)用,也可進(jìn)行下步操作。將懸液分裝于無菌離心管中,投入液氮,然后儲于-70℃保存。
四、結(jié)果 (略)
五、注意事項
一般地,新制備的感受態(tài)細(xì)胞48h后轉(zhuǎn)化效率降低,15d后失效。因此,感受態(tài)細(xì)胞不能保存太久,4℃保存一周,但-80℃可保存1年。用試管分裝可避免反復(fù)凍熔,損傷感受態(tài)細(xì)胞。