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技術文章
受體菌感受態細胞的制備方法
點擊次數:1368 發布時間:2016-7-4
目的與原理
當細菌處于容易吸收外源DNA的狀態時,即為感受態,而用理化手段使細菌處于感受態的操作為致敏過程。感受態細胞制備是重組基因能否實現轉化的一個重要的技術環節。本試驗是通過鈣離子來誘導使之成為感受態細胞。
二、材料和方法
1. 材料:大腸桿菌
2. 儀器:
離心機,恒溫搖床,恒溫水浴,超凈工作臺,冰柜
3. 試劑
lb培養基,0.1M MgCl2,3mM氯化六氮合高鈷
TFB:10Mm MES(pH6.3)
45Mm MnCl2
10Mm CaCl2
10Mm KCl
三、操作步驟
大腸桿菌在LB培養基平板上劃線培養12-16小時,挑取單菌落于LB培養基搖瓶培養大腸桿菌到對數期。取1ml培養物7000rpm,離心3min,收集菌體。再重復一次。冰浴放置。用預冷的氯化鎂懸浮菌體7000rpm離心3min。收集菌體,冰浴放置。用預冷的氯化鈣懸浮菌體,冰浴15min, 7000rpm離心3min。收集菌體,冰浴放置。加入200μl預冷的氯化鈣(或TFB),放置于冰浴,即得感受態細胞,此細胞可現用,也可進行下步操作。將懸液分裝于無菌離心管中,投入液氮,然后儲于-70℃保存。
四、結果 (略)
五、注意事項
一般地,新制備的感受態細胞48h后轉化效率降低,15d后失效。因此,感受態細胞不能保存太久,4℃保存一周,但-80℃可保存1年。用試管分裝可避免反復凍熔,損傷感受態細胞。