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microRNAs技術簡介
點擊次數：1587 發布時間：2016-6-22
micrornAs(miRNAs)是一種小的，類似于siRNA的分子，由高等真核生物基因組編碼，miRNA通過和靶基因mRNA堿基配對引導沉默復合體(RISC)降解mRNA或阻礙其翻譯。miRNAs在物種進 化中相當保守，在植物、動物和真菌中發現的miRNAs只在特定的組織和發育階段表達，miRNA組織特異性和時序性，決定組織和細胞的功能特異性，表明miRNA在細胞生長和發育過程的調節過程中起多種作用。盡管在10年前已經發表了*篇關于miRNA的論文，直到zui近miRNA的普遍性和重要性才逐漸被人們所認識。
miRNA的產生和作用機理
miRNA基因通常是在核內由RNA聚合酶II(polII)轉錄的，zui初產物為大的具有帽子結構(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的pre-miRNA。pre-miRNA在核酸酶Drosha和其輔助因子Pasha的作用下被處理成70個核苷酸組成的pre-miRNA。RAN–GTP和exportin 5將pre-miRNA輸送到細胞質中。隨后，另一個核酸酶Dicer將其剪切產生約為22個核苷酸長度的miRNA:miRNA*雙鏈。這種雙鏈很快被引導進入沉默復合體(RISC)復合體中，其中一條成熟的單鏈miRNA保留在這一復合體中。成熟的miRNA結合到與其互補的mRNA的位點通過堿基配對調控基因表達。
與靶mRNA不*互補的miRNA在蛋白質翻譯水平上抑制其表達(哺乳動物中比較普遍)。然而，zui近也有證據表明，這些miRNA也有可能影響mRNA的穩定性。使用這種機制的miRNA結合位點通常在mRNA的3’端非翻譯區。如果miRNA與靶位點*互補(或者幾乎*互補)，那么這些miRNA的結合往往引起靶mRNA的降解(在植物中比較常見)。通過這種機制作用的miRNAs的結合位點通常都在mRNA的編碼區或開放閱讀框中。每個miRNA可以有多個靶基因，而幾個miRNAs也可以調節同一個基因。這種復雜的調節網絡既可以通過一個miRNA來調控多個基因的表達，也可以通過幾個miRNAs的組合來精細調控某個基因的表達。隨著miRNA調控基因表達的研究的逐步深入，將幫助我們理解高等真核生物的基因組的復雜性和復雜的基因表達調控網絡。
miRNA在正常生理過程中的作用
目前只有一小部分miRNAs生物學功能得到闡明。這些miRNAs調節了細胞生長，組織分化，因而與生命過程中發育、疾病有關。通過對基因組上miRNA的位點分析，顯示其在發育和疾病中起了非常重要的作用。一系列的研究表明：miRNAs在細胞生長和凋亡，血細胞分化，同源異形盒基因調節，神經元的極性，胰島素分泌，大腦形態形成，心臟發生，胚胎后期發育等過程中發揮重要作用。例如，miR-273和lys-6編碼的miRNA，參與線蟲的神經系統發育過程;miR-430參與斑馬魚的大腦發育;miR-181控制哺乳動物血細胞分化為B細胞;miR-375調節哺乳動物胰島細胞發育和胰島素分泌;miR-143在脂肪細胞分化起作用;miR-196參與了哺乳動物四肢形成，miR-1與心臟發育有關。另有研究人員發現許多神經系統的miRNAs在大腦皮層培養中受到時序調節，表明其可能控制著區域化的mRNA翻譯。對于新的miRNA基因的分析，可能發現新的參與器官形成、胚胎發育和生長的調節因子，促進對癌癥等人類疾病發病機制的理解。
miRNAs與癌癥
zui近的研究發現，miRNA表達與多種癌癥相關，大約50%得到注解的miRNAs在基因組上定位于與腫瘤相關的脆性位點(fragile site)。這說明miRNAs在腫瘤發生過程中起至關重要的作用，這些miRNAs所起的作用類似于抑癌基因和癌基因的功能，有研究人員將miRNA命名為“oncomirs”。
充當抑癌基因作用的miRNA:
mir-125b-1，位于染色體的11q24脆性位點，乳腺癌、肺癌、卵巢癌、子宮癌病人中11q924位點常有缺失，而這一位點并不存在已知的抑癌基因。
65%B細胞慢性淋巴型白血病(CLL)病人，50%的套細胞淋巴瘤病人，16-40%的骨髓瘤病人、60%的前列腺癌病人中有13q14位點的缺失。因此，在這個30Kb的區域中必定有一個腫瘤抑制基因的存在。而mir-1和mir-16-1位于這一區域中一個功能未知的被稱為LEU2的非編碼蛋白的RNA基因的內含子區域。Climmino等zui近報道，miR-1和miR-16-1負調控BCL2，一個抗凋亡基因，因此，這兩個miRNAs的缺失或下調，導致了BCL2表達的升高，促進了白血病、淋巴瘤和前列腺癌的發生。
有研究報道，mir-143和mir-145在結腸癌中明顯下調。有趣的是，其發夾結構的前體分子在腫瘤和正常組織中含量相似，這表明，可能是由于其成熟過程受到破壞。mir-143和mir-145的腫瘤抑制基因功能不僅僅局限于結腸癌，在乳腺癌、前列腺癌、子宮癌、淋巴癌等細胞系中其表達量也明顯下調。
Takamizawa等發現肺癌病人的let-7表達顯著降低，并且這導致這些病人更差的預后，非小細胞肺癌病人的let-7表達水平越低，其預后越差，術后生存期越短。體外組織培養實驗表明，在人的肺癌細胞中瞬時的表達let-7可以抑制細胞的增殖，這也說明let-7在肺組織中可能是一個抑癌基因。實驗表明，在人類細胞中let-7通過3’非翻譯區域直接抑制癌基因Ras的表達。大約有15-30%的人類腫瘤都含有Ras突變，而激活的突變導致這個蛋白表達上升可以引起細胞轉化。因此，能夠調節Ras蛋白表達的let-7，可以控制細胞的增殖速度。
充當癌基因作用的miRNA：
miR-21在膠質母細胞瘤中表達增加。這個基因在腫瘤組織中表達量比正常組織高5-100倍。反義核酸的研究發現這個miRNA通過抑制凋亡而并非影響細胞增殖控制細胞生長，這預示著這個miRNA具有癌基因的功能。另一項獨立研究，利用芯片來檢測腫瘤和正常組織的245個miRNAs的表達水平，也發現膠質母細胞瘤中miR-21表達升高。由于mir-21不是一個大腦特異性的基因，在乳腺癌樣品中表達也有增加，這個基因可能在腫瘤發生中起到廣泛的作用。
Metzler等人發現，在BIC基因上具有一段138個核苷酸的保守序列，編碼mir-155的發夾結構。該研究組還發現在Burkitt淋巴瘤中，miR-155表達量上升了100倍，此外的研究也發現，Hodgkin淋巴瘤等腫瘤中miR-155水平也有提高。因此，mir-155可能是作為一個癌基因和MYC協同作用，而其正常功能是在B細胞的分化中起作用，其可能的靶基因是那些對抗MYC信號通路的基因。
He等人zui近發表的論文發現在散布的B細胞淋巴瘤、濾泡型淋巴瘤、套細胞淋巴瘤等腫瘤中常常有13q31位點的擴增。而在這一擴增區域的*的基因就是一個非編碼蛋白的RNA，C13orf25，這個轉錄本編碼了mir-17-92基因簇，其中包含了7個miRNAs：miR-17-5p，miR-17-3p，miR-18a，miR-19a，miR-20a，miR-19b-1，and miR-92-1。他們由此推斷，這個基因簇的過表達與腫瘤形成有關，而后通過實驗研究證明，過表達Myc和mir-17-19-b1基因簇淋巴癌與僅有Myc過表達腫瘤相比較，具有更強的增殖能力，更低的細胞死亡率。這些實驗證實，mir-17-19-b1中的miRNAs可以協同地行使癌基因的功能，其靶基因可能是在MYC過表達條件下激活的凋亡蛋白。當凋亡途徑被mir-17-19-b1去除，MYC可以誘導細胞不受控制地增殖，這導致了腫瘤發生。
O’Donnell等人單獨證明了mir-17-92基因簇是一組可能的腫瘤相關的基因。他們用miRNAs芯片篩選過表達MYC，B細胞系P493-6中miRNA表達變化。他們發現MYC誘導了mir-17-92的表達，而這些miRNAs可以抑制E2F1的翻譯。在這一模型中，mir-17-92基因簇所起的作用似乎是抑癌基因的作用，這與上面討論的He等人的發現是相反的。這其中可能的機理是，盡管E2F1可以促進細胞增殖，但是當E2F1的表達水平超過一閾值，它也可以引起凋亡，在此情況下，miRNAs對于E2F1的負調控可能是通過阻斷E2F1的誘導凋亡活性，從而促進MYC介導的細胞增殖，支持了He等提出的模型。
結論和展望
miRNA在細胞分化，生物發育及疾病發生發展過程中發揮巨大作用，越來越多的引起研究人員的關注。隨著對于miRNA作用機理的進一步的深入研究，以及利用的例如miRNA芯片等高通量的技術手段對于miRNA和疾病之間的關系進行研究，將會使人們對于高等真核生物基因表達調控的網絡理解提高到一個新的水平。這也將使miRNA可能成為疾病診斷的新的生物學標記，還可能使得這一分子成為藥靶，或是模擬這一分子進行新藥研發，這將可能會給人類疾病的治療提供一種新的手段。