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技術文章

DNA的限制性酶切及電泳分析實驗方法

點擊次數:3346 發布時間:2016-6-15

基本原理

限制性核酸內切酶是一類能識別雙鏈DNA中特定堿基順序的核酸水解酶(水解磷酸二酯鍵)。根據酶的識別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性,可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大類。通常所指的DNA限制性核酸內切酶就是Ⅱ型酶。

主要試劑

重組質粒DNA 插入片段300bp

本實驗所用限制性核酸內切酶為EcoRⅠ,其識別順序為:

5′----G↓AATT C----3′

3′----C TTAA↑G----5′

磷酸二脂鍵斷裂 產生5′粘性末端。

操作步驟

1. 反應體系的建立:

⑴ 在一無菌1.5 ml eppendorf管中加入:

無菌雙蒸水 7 μl

10×酶切緩沖液 2 μl

質粒DNA(100 ng/μl) 10 μl

EcoRⅠ(5 U/μl) 1 μl

總體積為20μl

⑵ 輕輕混勻,12000 rpm離心5 sec。

2. 37 ℃水浴1 h。

3. 將Eppendorf管置65 ℃水浴中10 min,通過加熱使酶失活以終止反應。

4. 12000 rpm離心5 sec,將管蓋及管壁上的水離下。

5. 取10 μl消化產物,與2 μl 6×上樣緩沖液混勻,瓊脂糖凝膠電泳檢測消化效果,電泳條件:約100 V 30~60 min。

6 結果觀察。

操作注意事項:

1. 吸樣量一定要準確

2. 為了不使酶污染而導致浪費,zui后才加酶

3. 要求在冰上操作,并充分混勻,

4. 開啟Eppendorf管時,手不要接觸到管蓋內面,以防污染。

5. 樣品在37 ℃與65 ℃保溫時,將離心管蓋嚴,以防水進入管內造成實驗失敗。

限制性內切酶酶解中常見的問題和原因

1. DNA*沒有被限制性內切酶切割:①限制性內切酶失活;②DNA不純,含有SDS、有機溶劑、EDTA等;③非限制性內切酶*反應條件;④酶切位點被修飾;⑤DNA上不存在該酶的識別順序。

2. DNA切割不*:①限制性內切酶活性下降或稀釋不正確;②DNA不純或反應條件不佳;③酶切位點被修飾;④部分DNA溶液粘在管壁上;⑤酶切后DNA粘末端退火。

3. DNA片段數目多于理論值:①限制性內切酶星號活力;②存在第二種限制性內切酶污染;③樣品DNA中含有其它DNA。

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