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簡單擴增體系中引物設(shè)計原則
點擊次數(shù):983 發(fā)布時間:2016-6-12
引物在PCR反應(yīng)中處于關(guān)鍵作用,引物決定著擴增的特異性和擴增的效率。而在目前DNA的化學(xué)合成技術(shù)非常成熟的情形下,引物設(shè)計是否合適是我們應(yīng)更為關(guān)注的層面。現(xiàn)在有很多的免費的軟件或網(wǎng)絡(luò)資源(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)能輔助我們進行引物設(shè)計,這使我們總能找到適合我們自己應(yīng)用的引物設(shè)計工具。筆者用得較多的引物設(shè)計軟件有oligo 6.0,Primer premier 5。需要說明的是經(jīng)過細致推敲和計算的引物并不能保證擴增一定能夠成功或,但嚴密的設(shè)計并系統(tǒng)地考慮一些應(yīng)該避免的問題,能使我們在大多數(shù)情形下找到我們所需要的引物。 筆者接觸PCR較早,較多地從事引物設(shè)計也有一年多的時間,其間也得到過許多老師的幫助指教,現(xiàn)將一些體會整理出來,希望能對大家有一些幫助,同時也盼望能得到更多的指點。
簡單擴增體系中引物設(shè)計原則:
簡單體系,是指擴增體系中模板較為單一且大部或全部模板序列已知,如經(jīng)過純化的短片段或純化后的重組質(zhì)粒等,是相對后面所提的復(fù)雜體系而言的一個粗略的分類。以下是一個大致的流程:
1, 考慮實驗本身對這對引物的要求。如:待擴增區(qū)域和擴增產(chǎn)物長度,擴增產(chǎn)物是否需要考慮移碼突變,是否需要在引物5’端引入酶切位點和引入哪些酶切位點,是否需要引入點突變,…… 依據(jù)具體的實驗而定。實際上,此步應(yīng)該是zui費時間和精力的一步。
2, 引物的Tm值。主要需要考慮的因素有:I, 反應(yīng)體系對引物退火溫度的影響;如酶的zui適工作溫度對引物退火溫度的限制等。II,擴增產(chǎn)物的Tm值。引物和產(chǎn)物的Tm值不要相差太大,20攝氏度范圍內(nèi)較好。定下引物的Tm值范圍之后即可定下引物的長度范圍。
3, 引物的二級結(jié)構(gòu)。包括引物自身二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物間二聚體等。這些因素會影響引物和模板的結(jié)合從而影響引物效率。對于3’末端且5’端突出的引物二聚體,應(yīng)控制其ΔG大于-5.0kcal/mol或少于三個連續(xù)的堿基互補,因為此種情形的引物二聚體有進一步形成更穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的可能性,引物中間或5’端可適當放寬。發(fā)卡結(jié)構(gòu)也以3’端或近3’端對引物-模板結(jié)合影響更大,影響發(fā)卡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性的因素除了堿基互補配對的鍵能之外,與莖環(huán)結(jié)構(gòu)亦有很大的關(guān)系。應(yīng)盡量避免3’末端有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的引物。
4, 擴增的特異性。好的設(shè)計工具會提供一個引物異位引發(fā)的評價指標,如oligo 6.0 的false priming efficiency,即異位引發(fā)效率,這個值是由程序根據(jù)引物自身二級結(jié)構(gòu)的能量、錯配的類型、錯配離3'末端的距離等因素綜合計算而得出,當此值大于200時便很有可能引發(fā)擴增。如所用工具無量化指標,則可依據(jù)經(jīng)驗,當引物與模板在非預(yù)期位置退火,超過70%的堿基能互補配對,或引物3’末端連續(xù)8個或以上堿基配對,則認為有引發(fā)的可能。
在簡單擴增體系中,當我們定好上述限制條件,如能找到適合這些條件的引物,便zui大可能地找到適合我們實驗的引物。如不能滿足上述所有條件,則按所列順序依次滿足,總的來說遵循這樣一個秩序:擴增出符合實驗需要的產(chǎn)物→擴增出能夠分辨分離的符合實驗需要的產(chǎn)物→特異地擴增出符合實驗需要的產(chǎn)物。同樣,這一先后秩序也適用于復(fù)雜的擴增體系。