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簡單擴(kuò)增體系中引物設(shè)計(jì)原則
點(diǎn)擊次數(shù)：1045 發(fā)布時(shí)間：2016-6-12
引物在PCR反應(yīng)中處于關(guān)鍵作用，引物決定著擴(kuò)增的特異性和擴(kuò)增的效率。而在目前DNA的化學(xué)合成技術(shù)非常成熟的情形下，引物設(shè)計(jì)是否合適是我們應(yīng)更為關(guān)注的層面?，F(xiàn)在有很多的免費(fèi)的軟件或網(wǎng)絡(luò)資源(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)能輔助我們進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，這使我們總能找到適合我們自己應(yīng)用的引物設(shè)計(jì)工具。筆者用得較多的引物設(shè)計(jì)軟件有oligo 6.0，Primer premier 5。需要說明的是經(jīng)過細(xì)致推敲和計(jì)算的引物并不能保證擴(kuò)增一定能夠成功或，但嚴(yán)密的設(shè)計(jì)并系統(tǒng)地考慮一些應(yīng)該避免的問題，能使我們?cè)诖蠖鄶?shù)情形下找到我們所需要的引物。 筆者接觸PCR較早，較多地從事引物設(shè)計(jì)也有一年多的時(shí)間，其間也得到過許多老師的幫助指教，現(xiàn)將一些體會(huì)整理出來，希望能對(duì)大家有一些幫助，同時(shí)也盼望能得到更多的指點(diǎn)。
簡單擴(kuò)增體系中引物設(shè)計(jì)原則：
簡單體系，是指擴(kuò)增體系中模板較為單一且大部或全部模板序列已知，如經(jīng)過純化的短片段或純化后的重組質(zhì)粒等，是相對(duì)后面所提的復(fù)雜體系而言的一個(gè)粗略的分類。以下是一個(gè)大致的流程：
1， 考慮實(shí)驗(yàn)本身對(duì)這對(duì)引物的要求。如：待擴(kuò)增區(qū)域和擴(kuò)增產(chǎn)物長度，擴(kuò)增產(chǎn)物是否需要考慮移碼突變，是否需要在引物5’端引入酶切位點(diǎn)和引入哪些酶切位點(diǎn)，是否需要引入點(diǎn)突變，…… 依據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)而定。實(shí)際上，此步應(yīng)該是zui費(fèi)時(shí)間和精力的一步。
2， 引物的Tm值。主要需要考慮的因素有：I, 反應(yīng)體系對(duì)引物退火溫度的影響;如酶的zui適工作溫度對(duì)引物退火溫度的限制等。II,擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值。引物和產(chǎn)物的Tm值不要相差太大，20攝氏度范圍內(nèi)較好。定下引物的Tm值范圍之后即可定下引物的長度范圍。
3， 引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)。包括引物自身二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物間二聚體等。這些因素會(huì)影響引物和模板的結(jié)合從而影響引物效率。對(duì)于3’末端且5’端突出的引物二聚體，應(yīng)控制其ΔG大于-5.0kcal/mol或少于三個(gè)連續(xù)的堿基互補(bǔ)，因?yàn)榇朔N情形的引物二聚體有進(jìn)一步形成更穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的可能性，引物中間或5’端可適當(dāng)放寬。發(fā)卡結(jié)構(gòu)也以3’端或近3’端對(duì)引物-模板結(jié)合影響更大，影響發(fā)卡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性的因素除了堿基互補(bǔ)配對(duì)的鍵能之外，與莖環(huán)結(jié)構(gòu)亦有很大的關(guān)系。應(yīng)盡量避免3’末端有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的引物。
4， 擴(kuò)增的特異性。好的設(shè)計(jì)工具會(huì)提供一個(gè)引物異位引發(fā)的評(píng)價(jià)指標(biāo)，如oligo 6.0 的false priming efficiency，即異位引發(fā)效率，這個(gè)值是由程序根據(jù)引物自身二級(jí)結(jié)構(gòu)的能量、錯(cuò)配的類型、錯(cuò)配離3'末端的距離等因素綜合計(jì)算而得出，當(dāng)此值大于200時(shí)便很有可能引發(fā)擴(kuò)增。如所用工具無量化指標(biāo)，則可依據(jù)經(jīng)驗(yàn)，當(dāng)引物與模板在非預(yù)期位置退火，超過70%的堿基能互補(bǔ)配對(duì)，或引物3’末端連續(xù)8個(gè)或以上堿基配對(duì)，則認(rèn)為有引發(fā)的可能。
在簡單擴(kuò)增體系中，當(dāng)我們定好上述限制條件，如能找到適合這些條件的引物，便zui大可能地找到適合我們實(shí)驗(yàn)的引物。如不能滿足上述所有條件，則按所列順序依次滿足，總的來說遵循這樣一個(gè)秩序：擴(kuò)增出符合實(shí)驗(yàn)需要的產(chǎn)物→擴(kuò)增出能夠分辨分離的符合實(shí)驗(yàn)需要的產(chǎn)物→特異地?cái)U(kuò)增出符合實(shí)驗(yàn)需要的產(chǎn)物。同樣，這一先后秩序也適用于復(fù)雜的擴(kuò)增體系。