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mRNA的分離純化
點擊次數：1032 發布時間：2016-6-2
真核生物的mRNA分子是單順反子，是編碼蛋白質的基因轉錄產物。真核生物的所有蛋白質歸根到底都是mRNA的翻譯產物，因此，高質量mRNA的分離純化是克隆基因、提高cdna文庫構建效率的決定性因素。哺乳動物平均每個細胞含有約1x10-5?g RNA，理論上認為每克細胞可分離出5～10mg RNA。其中 rRNA為75％～ 85％，tRNA占10％～16％，而mRNA僅占1%～5％，并且mRNA分子種類繁多，分子量大小不均一，表達豐度也不一樣。
真核生物mRNA有特征性的結構，即具有5’端帽子結構（m7G）和3’端的poly(A)尾巴——絕大多數哺乳動物細胞的3’端存在20~300個腺苷酸組成的poly（A）尾，通常用poly（A+）表示，這種結構為真核mRNA分子的提取、純化，提供了極為方便的選擇性標志，寡聚（dT）纖維素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎就在于此。
一般mRNA分離純化的原理就是根據mRNA 3’ 末端含有多poly(A)尾巴結構特性設計的。當總RNA流經寡聚（dT）（即oligo(dT)）纖維素柱時，在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異地吸附在oligo(dT)纖維素柱上，在低鹽濃度或蒸餾水中，mRNA可被洗下，經過兩次oligo(dT)纖維素柱，即可得到較純的mRNA。
目前常用的mRNA的純化方法有：
（1）寡聚（dT）－纖維素柱層析法，即分離mRNA的標準方法；
（2）寡聚（dT）－纖維素液相離心法，即用寡聚（dT）－纖維素直接加入到總的 RNA溶液中并使mRNA與寡聚（dT）－纖維素結合，離心收集寡聚（dT）－纖維素／mRNA復合物，再用洗脫液分離mRNA，然后離心除去寡聚（dT）－纖維素；
（3）其它一些方法：如寡聚（dT）－磁性球珠法等。
本實驗應用方法（1）進行mRNA的分離純化。
【試劑與器材】
（一）試劑
1． 0.1mol/L NaOH ，每組200mL
2． 寡聚Oligo（dT）-纖維素
3． 加樣/洗滌緩沖液1：0.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每組250mL
或0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(pH8.0), 0.1% SDS。
4． 洗滌緩沖液2：0.1 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每組250mL或10mmol/L Tris-HCl (pH7.6), 1mmol/L EDTA (pH8.0), 0.05% SDS。
配制時可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，經高壓消毒后按各成分確切含量，經混合后再高壓消毒，冷卻至65℃時，加入經65℃溫育（30min）的10%SDS至終濃度。
5． 5 mol/L NaCl，每組10mL
6． 3 mol/L NaAc pH5.2，每組10mL
7． 無RNase雙蒸水(DEPC水)，每組100mL
8． 70%乙醇，每組10mL
注意：溶液5，6的配制都應該加0.1% DEPC處理，溶液1，3，4，8則用經0.1% DEPC處理過的無RNase雙蒸水配制，Tris應選用無RNase的級別。溶液配制后，能夠按一次實驗所需的分量分裝成多瓶（如10ml或50ml/瓶）保存，每次實驗只用一份，避免多次操作造成對溶液的污染。
（二）器材
1． 恒溫水浴箱
2． 冷凍高速離心機
3． 紫外分光光度計
4． 巴斯德吸管
5． 玻璃棉
6． 5ml一次性注射器
【操作方法】
（一） oligo(dT)纖維素的預處理
1． 用0.1mol/L NaOH懸浮0.5-1.0g oligo(dT)纖維素。
2． 將懸浮液裝入填有經DEPC水處理并經高壓滅菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床體積為0.5-1.0mL，用3倍柱床體積的無RNase的滅菌雙蒸水沖洗oligo(dT)纖維素。
3． 用3-5倍柱床洗滌緩沖液I沖洗oligo(dT)纖維素，直到流出液的pH值小于8.0。
4． 將處理好的oligo(dT)纖維素從巴斯德吸管倒出，用適當的柱床洗滌緩沖液I懸浮，濃度約為0.1g/mL，保存在4℃待用。
（二） 總RNA濃度的調整
1． 把實驗一所提的總RNA轉到適合的離心管中，如果總RNA的濃度大于0.55mg/mL，則用無RNase的雙蒸水稀釋至0.55mg/mL，總RNA的濃度對除去rRNA是很重要的。把RNA溶液置于65℃水浴加熱5 分鐘，然后迅速插在冰上冷卻。
2． 加入1/10體積5 mol/L NaCl使RNA溶液中鹽的濃度調至0.5 mol/L。
（三） mRNA的分離
1． mRNA與Oligo(dT)-纖維素結合：用移液器重新懸浮oligo(dT)-纖維素，按下表取適量的oligo(dT)-纖維素到RNA樣品中，蓋上蓋子，顛倒數次將oligo(dT)-纖維素與RNA混勻。于37℃水浴保溫并溫和搖蕩15分鐘。
總RNA (mg)寡聚Oligo(dT)-纖維素(mL)洗滌緩沖液1，2 (mL)洗脫體積(mL)<0.20.21.01.00.2-0.50.51.51.50.5-1.01.03.03.01.0-2.02.05.05.0
2． 轉移：取1個5ml的一次性注射器，取適量經過高溫滅菌的玻璃棉塞緊前端，并把它固定在無RNase的支架上，再把oligo(dT)-纖維素/RNA懸浮液轉移到注射器，推進塞子直至底部，把含有未結合上的RNA液體排到無RNase的離心管中（保留至確定獲得足夠的mRNA）。
3． 洗滌：根據上表直接用注射器慢慢吸取適量的洗滌緩沖液1，溫和振蕩，充分重新懸浮mRNA-oligo(dT)-纖維素，推進塞子，用無RNase的離心管收集洗出液。測定每一管的OD260，當洗出液中OD為0時準備洗脫。
4． 洗脫：根據上表直接用注射器慢慢吸取適量（2-3倍柱床體積）的洗脫緩沖液2或無RNase雙蒸水到注射器內充分重懸mRNA-oligo(dT)-纖維素，推進塞子以1/3至1/2柱床體積分管收集洗脫液。
5． 測定每一管的OD260，合并含有RNA的洗脫液組分于4℃，2500g，離心2-3分鐘，上清轉移至新的離心管中，去掉殘余的oligo(dT)-纖維素。
6． 沉淀：洗脫液中加入1/10體積的3mol/L NaAc （pH5.2）, 再加入2.5倍體積的冰冷乙醇，混勻后，-20℃30分鐘或放置
。
7． 離心收集：12000g, 4℃離心15分鐘，小心棄去上清，mRNA沉淀此時往往看不見，用70%乙醇漂洗沉淀，12000g, 4℃離心5 分鐘，小心棄去上清液，沉淀空氣干燥10分鐘，或真空干燥10分鐘。將mRNA沉淀溶于適當體積的無RNase的雙蒸水，立即用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并貯存于-70℃）。
8． 定量：測定OD260和OD280，計算產率以及OD260/OD280的比率（同上一實驗）。
【注意事項與提示】
1． 整個操作過程必須嚴格遵守無RNase操作環境規則。
2． 提取的總RNA必須完整，不能被降解，這是mRNA質量的先決條件。
3． 總RNA與Oligo(dT)-纖維素的比例要適當，過量的總RNA，容易造成mRNA不純。
4． RNA溶液與Oligo(dT)-纖維素結合前必須置于65℃加熱5 分鐘，這一步很重要，其作用（1）破壞mRNA的二級結構，特別是poly(A+)尾處的二級結構，使poly(A+)尾充分暴露，提高poly(A+)RNA回收率；（2）解離mRNA與rRNA的結合。加熱后應立即插入冰上，以免由于溫度的緩慢下降使mRNA又恢復其二級結構。
5． 應注意mRNA不能被DNA污染，即使是1 ppm DNA污染，也可嚴重影響實驗結果。
6． mRNA制備后，可用變性瓊脂糖凝膠電泳撿測其完整性和有無DNA污染。提取的mRNA應該在0.5~8.0kb之間呈現彌散狀，無明顯區帶，但大部分的mRNA應在1-2.0kb范圍內（如下圖）。一般來說，經過一次純化分離的mRNA還會有微量的rRNA殘留，但一般來說不會對后續實驗造成很大的影響，如果樣品充足，可將經過一次純化分離的mRNA再純化一次，進一步提高其純度。
三 mRNA的分離純化
圖3.1 mRNA變性瓊脂糖凝膠電泳示意圖
Lane 1, 0.24–7.5kb RNA分子量Maker;
Lane 2, 老鼠肝臟總 RNA;
Lane 3, 老鼠肝臟mRNA
7． 為防止mRNA降解，應避免多次凍融，可將mRNA少量分裝后保存。另外，如果有低溫冰箱,在 -70℃～ -80℃保存。 也可將mRNA在70%乙醇中-70℃保存一年以上。
8． 寡聚(dT)纖維素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗凈，然后用層析柱加樣緩沖液平衡，并加入0.02%疊氮鈉（NaN3)冰箱保存，重復使用。每次用前需用NaOH、滅菌 ddH2O、層析柱加樣緩沖液依次淋洗柱床。
9． 一般而言，107哺乳動物培養細胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA，約相當于上柱總RNA量的1%-2%。
【實驗安排】
1． *天：試劑的配制和所用一次性塑料制品和玻璃器皿的去RNase處理（0.1%DEPC浸泡或高溫干烤）。
2． 第二天：進行（一）、（二）和（三）1-6。
3． 第三天：進行（三）7和變性瓊脂糖凝膠電泳撿測mRNA。
4． 為了避免由于保存時間過長造成的RNA降解，能將總RNA提取、、RT-PCR和cDNA文庫構建實驗安排在連續的時間內進行。