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mRNA的分離純化
點擊次數:972 發布時間:2016-6-2
真核生物的mRNA分子是單順反子,是編碼蛋白質的基因轉錄產物。真核生物的所有蛋白質歸根到底都是mRNA的翻譯產物,因此,高質量mRNA的分離純化是克隆基因、提高cdna文庫構建效率的決定性因素。哺乳動物平均每個細胞含有約1x10-5?g RNA,理論上認為每克細胞可分離出5~10mg RNA。其中 rRNA為75%~ 85%,tRNA占10%~16%,而mRNA僅占1%~5%,并且mRNA分子種類繁多,分子量大小不均一,表達豐度也不一樣。
真核生物mRNA有特征性的結構,即具有5’端帽子結構(m7G)和3’端的poly(A)尾巴——絕大多數哺乳動物細胞的3’端存在20~300個腺苷酸組成的poly(A)尾,通常用poly(A+)表示,這種結構為真核mRNA分子的提取、純化,提供了極為方便的選擇性標志,寡聚(dT)纖維素或寡聚(U)瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎就在于此。
一般mRNA分離純化的原理就是根據mRNA 3’ 末端含有多poly(A)尾巴結構特性設計的。當總RNA流經寡聚(dT)(即oligo(dT))纖維素柱時,在高鹽緩沖液作用下,mRNA被特異地吸附在oligo(dT)纖維素柱上,在低鹽濃度或蒸餾水中,mRNA可被洗下,經過兩次oligo(dT)纖維素柱,即可得到較純的mRNA。
目前常用的mRNA的純化方法有:
(1)寡聚(dT)-纖維素柱層析法,即分離mRNA的標準方法;
(2)寡聚(dT)-纖維素液相離心法,即用寡聚(dT)-纖維素直接加入到總的 RNA溶液中并使mRNA與寡聚(dT)-纖維素結合,離心收集寡聚(dT)-纖維素/mRNA復合物,再用洗脫液分離mRNA,然后離心除去寡聚(dT)-纖維素;
(3)其它一些方法:如寡聚(dT)-磁性球珠法等。
本實驗應用方法(1)進行mRNA的分離純化。
【試劑與器材】
(一)試劑
1. 0.1mol/L NaOH ,每組200mL
2. 寡聚Oligo(dT)-纖維素
3. 加樣/洗滌緩沖液1:0.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6),每組250mL
或0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(pH8.0), 0.1% SDS。
4. 洗滌緩沖液2:0.1 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6),每組250mL或10mmol/L Tris-HCl (pH7.6), 1mmol/L EDTA (pH8.0), 0.05% SDS。
配制時可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA(pH 8.0)的母液,經高壓消毒后按各成分確切含量,經混合后再高壓消毒,冷卻至65℃時,加入經65℃溫育(30min)的10%SDS至終濃度。
5. 5 mol/L NaCl,每組10mL
6. 3 mol/L NaAc pH5.2,每組10mL
7. 無RNase雙蒸水(DEPC水),每組100mL
8. 70%乙醇,每組10mL
注意:溶液5,6的配制都應該加0.1% DEPC處理,溶液1,3,4,8則用經0.1% DEPC處理過的無RNase雙蒸水配制,Tris應選用無RNase的級別。溶液配制后,能夠按一次實驗所需的分量分裝成多瓶(如10ml或50ml/瓶)保存,每次實驗只用一份,避免多次操作造成對溶液的污染。
(二)器材
1. 恒溫水浴箱
2. 冷凍高速離心機
3. 紫外分光光度計
4. 巴斯德吸管
5. 玻璃棉
6. 5ml一次性注射器
【操作方法】
(一) oligo(dT)纖維素的預處理
1. 用0.1mol/L NaOH懸浮0.5-1.0g oligo(dT)纖維素。
2. 將懸浮液裝入填有經DEPC水處理并經高壓滅菌的玻璃棉的巴斯德吸管中,柱床體積為0.5-1.0mL,用3倍柱床體積的無RNase的滅菌雙蒸水沖洗oligo(dT)纖維素。
3. 用3-5倍柱床洗滌緩沖液I沖洗oligo(dT)纖維素,直到流出液的pH值小于8.0。
4. 將處理好的oligo(dT)纖維素從巴斯德吸管倒出,用適當的柱床洗滌緩沖液I懸浮,濃度約為0.1g/mL,保存在4℃待用。
(二) 總RNA濃度的調整
1. 把實驗一所提的總RNA轉到適合的離心管中,如果總RNA的濃度大于0.55mg/mL,則用無RNase的雙蒸水稀釋至0.55mg/mL,總RNA的濃度對除去rRNA是很重要的。把RNA溶液置于65℃水浴加熱5 分鐘,然后迅速插在冰上冷卻。
2. 加入1/10體積5 mol/L NaCl使RNA溶液中鹽的濃度調至0.5 mol/L。
(三) mRNA的分離
1. mRNA與Oligo(dT)-纖維素結合:用移液器重新懸浮oligo(dT)-纖維素,按下表取適量的oligo(dT)-纖維素到RNA樣品中,蓋上蓋子,顛倒數次將oligo(dT)-纖維素與RNA混勻。于37℃水浴保溫并溫和搖蕩15分鐘。
總RNA (mg)寡聚Oligo(dT)-纖維素(mL)洗滌緩沖液1,2 (mL)洗脫體積(mL)<0.20.21.01.00.2-0.50.51.51.50.5-1.01.03.03.01.0-2.02.05.05.0
2. 轉移:取1個5ml的一次性注射器,取適量經過高溫滅菌的玻璃棉塞緊前端,并把它固定在無RNase的支架上,再把oligo(dT)-纖維素/RNA懸浮液轉移到注射器,推進塞子直至底部,把含有未結合上的RNA液體排到無RNase的離心管中(保留至確定獲得足夠的mRNA)。
3. 洗滌:根據上表直接用注射器慢慢吸取適量的洗滌緩沖液1,溫和振蕩,充分重新懸浮mRNA-oligo(dT)-纖維素,推進塞子,用無RNase的離心管收集洗出液。測定每一管的OD260,當洗出液中OD為0時準備洗脫。
4. 洗脫:根據上表直接用注射器慢慢吸取適量(2-3倍柱床體積)的洗脫緩沖液2或無RNase雙蒸水到注射器內充分重懸mRNA-oligo(dT)-纖維素,推進塞子以1/3至1/2柱床體積分管收集洗脫液。
5. 測定每一管的OD260,合并含有RNA的洗脫液組分于4℃,2500g,離心2-3分鐘,上清轉移至新的離心管中,去掉殘余的oligo(dT)-纖維素。
6. 沉淀:洗脫液中加入1/10體積的3mol/L NaAc (pH5.2), 再加入2.5倍體積的冰冷乙醇,混勻后,-20℃30分鐘或放置
。
7. 離心收集:12000g, 4℃離心15分鐘,小心棄去上清,mRNA沉淀此時往往看不見,用70%乙醇漂洗沉淀,12000g, 4℃離心5 分鐘,小心棄去上清液,沉淀空氣干燥10分鐘,或真空干燥10分鐘。將mRNA沉淀溶于適當體積的無RNase的雙蒸水,立即用于cDNA合成(或保存在70%乙醇中并貯存于-70℃)。
8. 定量:測定OD260和OD280,計算產率以及OD260/OD280的比率(同上一實驗)。
【注意事項與提示】
1. 整個操作過程必須嚴格遵守無RNase操作環境規則。
2. 提取的總RNA必須完整,不能被降解,這是mRNA質量的先決條件。
3. 總RNA與Oligo(dT)-纖維素的比例要適當,過量的總RNA,容易造成mRNA不純。
4. RNA溶液與Oligo(dT)-纖維素結合前必須置于65℃加熱5 分鐘,這一步很重要,其作用(1)破壞mRNA的二級結構,特別是poly(A+)尾處的二級結構,使poly(A+)尾充分暴露,提高poly(A+)RNA回收率;(2)解離mRNA與rRNA的結合。加熱后應立即插入冰上,以免由于溫度的緩慢下降使mRNA又恢復其二級結構。
5. 應注意mRNA不能被DNA污染,即使是1 ppm DNA污染,也可嚴重影響實驗結果。
6. mRNA制備后,可用變性瓊脂糖凝膠電泳撿測其完整性和有無DNA污染。提取的mRNA應該在0.5~8.0kb之間呈現彌散狀,無明顯區帶,但大部分的mRNA應在1-2.0kb范圍內(如下圖)。一般來說,經過一次純化分離的mRNA還會有微量的rRNA殘留,但一般來說不會對后續實驗造成很大的影響,如果樣品充足,可將經過一次純化分離的mRNA再純化一次,進一步提高其純度。
三 mRNA的分離純化
圖3.1 mRNA變性瓊脂糖凝膠電泳示意圖
Lane 1, 0.24–7.5kb RNA分子量Maker;
Lane 2, 老鼠肝臟總 RNA;
Lane 3, 老鼠肝臟mRNA
7. 為防止mRNA降解,應避免多次凍融,可將mRNA少量分裝后保存。另外,如果有低溫冰箱,在 -70℃~ -80℃保存。 也可將mRNA在70%乙醇中-70℃保存一年以上。
8. 寡聚(dT)纖維素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗凈,然后用層析柱加樣緩沖液平衡,并加入0.02%疊氮鈉(NaN3)冰箱保存,重復使用。每次用前需用NaOH、滅菌 ddH2O、層析柱加樣緩沖液依次淋洗柱床。
9. 一般而言,107哺乳動物培養細胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA,約相當于上柱總RNA量的1%-2%。
【實驗安排】
1. *天:試劑的配制和所用一次性塑料制品和玻璃器皿的去RNase處理(0.1%DEPC浸泡或高溫干烤)。
2. 第二天:進行(一)、(二)和(三)1-6。
3. 第三天:進行(三)7和變性瓊脂糖凝膠電泳撿測mRNA。
4. 為了避免由于保存時間過長造成的RNA降解,能將總RNA提取、、RT-PCR和cDNA文庫構建實驗安排在連續的時間內進行。