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植物DNA的提取與測定
點(diǎn)擊次數(shù):1415 發(fā)布時(shí)間:2016-5-23
一、目的
隨著基因工程等分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展及廣泛應(yīng)用,人們經(jīng)常需要提取高分子量的植物DNA,用于構(gòu)建基因文庫、基因組 southern 分析、酶切及克隆等,這是研究基因結(jié)構(gòu)和功能的重要步驟。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菍W(xué)習(xí)從植物材料中提取和測定DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法,進(jìn)一步了解DNA 的性質(zhì)。
二、原理
細(xì)胞中的DNA 絕大多數(shù)以DNA-蛋白復(fù)合物(DNP)的形式存在于細(xì)胞核內(nèi)。提取DNA 時(shí),一般先破碎細(xì)胞釋放出DNP,再用含少量異戊醇的氯仿除去蛋白質(zhì),zui后用乙醇把DNA 從抽提液中沉淀出來。DNP 與核糖核蛋白(RNP)在不同濃度的電解質(zhì)溶液中溶解度差別很大,利用這一特性可將二者分離。以NaCl 溶液為例:RNP 在0.14mol/L NaCl中溶解度很大,而DNP 在其中的溶解度僅為純水中的1%。當(dāng)NaCl 濃度逐漸增大時(shí),RNP的溶解度變化不大,而DNP 的溶解則隨之不斷增加。當(dāng)NaCl 濃度大于1mol/L 時(shí),DNP的溶解度zui大,為純水中溶解度的2 倍,因此通常可用1.4mol/L NaCl 提取DNA。為了得到純的DNA 制品,可用適量的RNase 處理提取液,以降解DNA 中攙雜的RNA。
關(guān)于植物總DNA 的提取主要有兩種方法:
1. CTAB 法:
CTAB(十六烷基*基溴化銨,hexadecyltrimethylammonium bromide, 簡稱CTAB):
是一種陽離子去污劑,可溶解細(xì)胞膜,它能與核酸形成復(fù)合物,在高鹽溶液中(0.7mol/LNaCl)是可溶的,當(dāng)降低溶液鹽的濃度到一定程度(0.3 mol/L NaCl)時(shí)從溶液中沉淀,通過離心就可將CTAB 與核酸的復(fù)合物同蛋白、多糖類物質(zhì)分開,然后將CTAB 與核酸的復(fù)合物沉淀溶解于高鹽溶液中,再加入乙醇使核酸沉淀,CTAB 能溶解于乙醇中。
2. SDS 法:
利用高濃度的陰離子去垢劑SDS(十二烷基磺酸鈉,Sodium dodecyl sulfate, 簡稱SDS)使DNA 與蛋白質(zhì)分離,在高溫(55~65℃)條件下裂解細(xì)胞,使染色體離析,蛋白變性,釋放出核酸,然后采用提高鹽濃度及降低溫度的方法使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀,離心后除去沉淀,上清液中的DNA用酚/氯仿抽提,反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。一般生物體的基因組DNA 為107~109bp,在基因克隆工作中,通常要求制備的大分子DNA 的分子量為克隆片段長度的4 倍以上,否則會由于制備過程中隨機(jī)斷裂的末端多為平末端,導(dǎo)致酶切后有效末端太少,可用于克隆的比例太低,嚴(yán)重影響克隆工作。因此有效制備大分子DNA 的方法必須考慮兩個原則:(1)盡量去除蛋白質(zhì)、RNA、次生代謝物質(zhì)(如多酚、類黃酮等)、多糖等雜質(zhì),并防止和抑制內(nèi)源DNase 對DNA 的降解。(2)盡量減少對溶液中DNA 的機(jī)械剪切破壞。
幾乎所有的DNase 都需要Mg2+或Mn2+為輔因子,故實(shí)現(xiàn)(1)盡量去除蛋白質(zhì)的要求,需加入一定濃度的螯合劑,如EDTA、檸檬酸,而且整個提取過程應(yīng)在較低溫度下進(jìn)行(一般利用液氮或冰浴)。為實(shí)現(xiàn)(2)需要在DNA 處于溶解狀態(tài)時(shí),盡量減弱溶液的渦旋,而且動作要輕柔,在進(jìn)行DNA 溶液轉(zhuǎn)移時(shí)用大口(或剪口)吸管。提取的DNA 是否為純凈、雙鏈、高分子的化合物,一般要通過紫外吸收、化學(xué)測定、“熔點(diǎn)”(melting temperature, Tm)測定、電鏡觀察及電泳分離等方法鑒定。本實(shí)驗(yàn)采用CTAB 法提取DNA 并通過紫外吸收法鑒定。
三、實(shí)驗(yàn)材料、主要儀器和試劑
1.實(shí)驗(yàn)材料
新鮮菠菜幼嫩組織、花椰菜花冠或小麥黃化苗等
2.主要儀器
(1)高速冷凍離心機(jī)
(2)751 型分光光度計(jì)
(3)恒溫水浴
(3)液氮或冰浴設(shè)備
(4)磨口錐形瓶
(5)核酸電泳設(shè)備
3.試劑(CTAB 法)
(1)CTAB 提取緩沖液:100 mmol/L Tris-HCl (pH8.0),20 mmol/L EDTA-Na2,1.4mol/LNaCl(如表1),2% CTAB,使用前加入0.1%(V/V)的β-巰基乙醇。
表1 CTAB提取緩沖液配制
植物DNA的提取與測定
用HCl 調(diào)pH 值。
(2)TE 緩沖液:10mmol/L Tris-HCl, 1mM EDTA( pH8.0)。