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植物DNA的提取與測(cè)定
點(diǎn)擊次數(shù)：1362 發(fā)布時(shí)間：2016-5-23
一、目的
隨著基因工程等分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展及廣泛應(yīng)用，人們經(jīng)常需要提取高分子量的植物DNA，用于構(gòu)建基因文庫(kù)、基因組 southern 分析、酶切及克隆等，這是研究基因結(jié)構(gòu)和功能的重要步驟。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菍W(xué)習(xí)從植物材料中提取和測(cè)定DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法，進(jìn)一步了解DNA 的性質(zhì)。
二、原理
細(xì)胞中的DNA 絕大多數(shù)以DNA-蛋白復(fù)合物（DNP）的形式存在于細(xì)胞核內(nèi)。提取DNA 時(shí)，一般先破碎細(xì)胞釋放出DNP，再用含少量異戊醇的氯仿除去蛋白質(zhì)，zui后用乙醇把DNA 從抽提液中沉淀出來。DNP 與核糖核蛋白（RNP）在不同濃度的電解質(zhì)溶液中溶解度差別很大，利用這一特性可將二者分離。以NaCl 溶液為例：RNP 在0.14mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP 在其中的溶解度僅為純水中的1％。當(dāng)NaCl 濃度逐漸增大時(shí)，RNP的溶解度變化不大，而DNP 的溶解則隨之不斷增加。當(dāng)NaCl 濃度大于1mol/L 時(shí)，DNP的溶解度zui大，為純水中溶解度的2 倍，因此通常可用1.4mol/L NaCl 提取DNA。為了得到純的DNA 制品，可用適量的RNase 處理提取液，以降解DNA 中攙雜的RNA。
關(guān)于植物總DNA 的提取主要有兩種方法：
1． CTAB 法：
CTAB（十六烷基*基溴化銨，hexadecyltrimethylammonium bromide, 簡(jiǎn)稱CTAB）：
是一種陽(yáng)離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，它能與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，當(dāng)降低溶液鹽的濃度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）時(shí)從溶液中沉淀，通過離心就可將CTAB 與核酸的復(fù)合物同蛋白、多糖類物質(zhì)分開，然后將CTAB 與核酸的復(fù)合物沉淀溶解于高鹽溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。
2． SDS 法：
利用高濃度的陰離子去垢劑SDS（十二烷基磺酸鈉，Sodium dodecyl sulfate, 簡(jiǎn)稱SDS）使DNA 與蛋白質(zhì)分離，在高溫（55～65℃）條件下裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸，然后采用提高鹽濃度及降低溫度的方法使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。一般生物體的基因組DNA 為107~109bp，在基因克隆工作中，通常要求制備的大分子DNA 的分子量為克隆片段長(zhǎng)度的4 倍以上，否則會(huì)由于制備過程中隨機(jī)斷裂的末端多為平末端，導(dǎo)致酶切后有效末端太少，可用于克隆的比例太低，嚴(yán)重影響克隆工作。因此有效制備大分子DNA 的方法必須考慮兩個(gè)原則：（1）盡量去除蛋白質(zhì)、RNA、次生代謝物質(zhì)（如多酚、類黃酮等）、多糖等雜質(zhì)，并防止和抑制內(nèi)源DNase 對(duì)DNA 的降解。（2）盡量減少對(duì)溶液中DNA 的機(jī)械剪切破壞。
幾乎所有的DNase 都需要Mg2+或Mn2+為輔因子，故實(shí)現(xiàn)（1）盡量去除蛋白質(zhì)的要求，需加入一定濃度的螯合劑，如EDTA、檸檬酸，而且整個(gè)提取過程應(yīng)在較低溫度下進(jìn)行（一般利用液氮或冰浴）。為實(shí)現(xiàn)（2）需要在DNA 處于溶解狀態(tài)時(shí)，盡量減弱溶液的渦旋，而且動(dòng)作要輕柔，在進(jìn)行DNA 溶液轉(zhuǎn)移時(shí)用大口（或剪口）吸管。提取的DNA 是否為純凈、雙鏈、高分子的化合物，一般要通過紫外吸收、化學(xué)測(cè)定、“熔點(diǎn)”（melting temperature, Tm）測(cè)定、電鏡觀察及電泳分離等方法鑒定。本實(shí)驗(yàn)采用CTAB 法提取DNA 并通過紫外吸收法鑒定。
三、實(shí)驗(yàn)材料、主要儀器和試劑
1．實(shí)驗(yàn)材料
新鮮菠菜幼嫩組織、花椰菜花冠或小麥黃化苗等
2．主要儀器
（1）高速冷凍離心機(jī)
（2）751 型分光光度計(jì)
（3）恒溫水浴
（3）液氮或冰浴設(shè)備
（4）磨口錐形瓶
（5）核酸電泳設(shè)備
3．試劑（CTAB 法）
（1）CTAB 提取緩沖液：100 mmol/L Tris-HCl （pH8.0），20 mmol/L EDTA-Na2，1.4mol/LNaCl（如表1），2% CTAB，使用前加入0.1%（V/V）的β-巰基乙醇。
表1 CTAB提取緩沖液配制
植物DNA的提取與測(cè)定
用HCl 調(diào)pH 值。
（2）TE 緩沖液：10mmol/L Tris-HCl, 1mM EDTA（ pH8.0）。