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植物DNA的提取與測定
點擊次數:1330 發布時間:2016-5-23
一、目的
隨著基因工程等分子生物學技術的迅速發展及廣泛應用,人們經常需要提取高分子量的植物DNA,用于構建基因文庫、基因組 southern 分析、酶切及克隆等,這是研究基因結構和功能的重要步驟。本實驗目的是學習從植物材料中提取和測定DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法,進一步了解DNA 的性質。
二、原理
細胞中的DNA 絕大多數以DNA-蛋白復合物(DNP)的形式存在于細胞核內。提取DNA 時,一般先破碎細胞釋放出DNP,再用含少量異戊醇的氯仿除去蛋白質,zui后用乙醇把DNA 從抽提液中沉淀出來。DNP 與核糖核蛋白(RNP)在不同濃度的電解質溶液中溶解度差別很大,利用這一特性可將二者分離。以NaCl 溶液為例:RNP 在0.14mol/L NaCl中溶解度很大,而DNP 在其中的溶解度僅為純水中的1%。當NaCl 濃度逐漸增大時,RNP的溶解度變化不大,而DNP 的溶解則隨之不斷增加。當NaCl 濃度大于1mol/L 時,DNP的溶解度zui大,為純水中溶解度的2 倍,因此通常可用1.4mol/L NaCl 提取DNA。為了得到純的DNA 制品,可用適量的RNase 處理提取液,以降解DNA 中攙雜的RNA。
關于植物總DNA 的提取主要有兩種方法:
1. CTAB 法:
CTAB(十六烷基*基溴化銨,hexadecyltrimethylammonium bromide, 簡稱CTAB):
是一種陽離子去污劑,可溶解細胞膜,它能與核酸形成復合物,在高鹽溶液中(0.7mol/LNaCl)是可溶的,當降低溶液鹽的濃度到一定程度(0.3 mol/L NaCl)時從溶液中沉淀,通過離心就可將CTAB 與核酸的復合物同蛋白、多糖類物質分開,然后將CTAB 與核酸的復合物沉淀溶解于高鹽溶液中,再加入乙醇使核酸沉淀,CTAB 能溶解于乙醇中。
2. SDS 法:
利用高濃度的陰離子去垢劑SDS(十二烷基磺酸鈉,Sodium dodecyl sulfate, 簡稱SDS)使DNA 與蛋白質分離,在高溫(55~65℃)條件下裂解細胞,使染色體離析,蛋白變性,釋放出核酸,然后采用提高鹽濃度及降低溫度的方法使蛋白質及多糖雜質沉淀,離心后除去沉淀,上清液中的DNA用酚/氯仿抽提,反復抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。一般生物體的基因組DNA 為107~109bp,在基因克隆工作中,通常要求制備的大分子DNA 的分子量為克隆片段長度的4 倍以上,否則會由于制備過程中隨機斷裂的末端多為平末端,導致酶切后有效末端太少,可用于克隆的比例太低,嚴重影響克隆工作。因此有效制備大分子DNA 的方法必須考慮兩個原則:(1)盡量去除蛋白質、RNA、次生代謝物質(如多酚、類黃酮等)、多糖等雜質,并防止和抑制內源DNase 對DNA 的降解。(2)盡量減少對溶液中DNA 的機械剪切破壞。
幾乎所有的DNase 都需要Mg2+或Mn2+為輔因子,故實現(1)盡量去除蛋白質的要求,需加入一定濃度的螯合劑,如EDTA、檸檬酸,而且整個提取過程應在較低溫度下進行(一般利用液氮或冰浴)。為實現(2)需要在DNA 處于溶解狀態時,盡量減弱溶液的渦旋,而且動作要輕柔,在進行DNA 溶液轉移時用大口(或剪口)吸管。提取的DNA 是否為純凈、雙鏈、高分子的化合物,一般要通過紫外吸收、化學測定、“熔點”(melting temperature, Tm)測定、電鏡觀察及電泳分離等方法鑒定。本實驗采用CTAB 法提取DNA 并通過紫外吸收法鑒定。
三、實驗材料、主要儀器和試劑
1.實驗材料
新鮮菠菜幼嫩組織、花椰菜花冠或小麥黃化苗等
2.主要儀器
(1)高速冷凍離心機
(2)751 型分光光度計
(3)恒溫水浴
(3)液氮或冰浴設備
(4)磨口錐形瓶
(5)核酸電泳設備
3.試劑(CTAB 法)
(1)CTAB 提取緩沖液:100 mmol/L Tris-HCl (pH8.0),20 mmol/L EDTA-Na2,1.4mol/LNaCl(如表1),2% CTAB,使用前加入0.1%(V/V)的β-巰基乙醇。
表1 CTAB提取緩沖液配制
植物DNA的提取與測定
用HCl 調pH 值。
(2)TE 緩沖液:10mmol/L Tris-HCl, 1mM EDTA( pH8.0)。